急性肺損傷肺微血管內皮細胞間隙連接蛋白40與血管通透性的關系研究.pdf

1、為探索急性肺損傷（ALI）時肺血管內皮細胞間隙連接蛋白40（Cx40）的表達，連接通道（GJC）功能的狀態(tài)改變，細胞損傷以及細胞內鈣濃度的變化與內皮細胞通透性之間的關系，本研究進行了下列三部分實驗。
　　實驗一.急性肺損傷兔肺組織通透性改變與Cx40的表達研究
　　目的：觀察ALI時家兔肺組織通透性與微血管內皮細胞Cx40表達的關系。
　　方法：應用胸部戰(zhàn)傷方法建立家兔急性肺損傷模型，將傷后經過簡單救治存活下來的家兔隨

2、機分為6組，每組6例，每例動物在傷前、傷后6、12、24、48，72小時取動脈血檢測IL-8和TNF-α含量；于各時段分別處死動物，取肺組織做HE病理和免疫組織化學染色（Cx40）；伊文思藍漏出率法測肺微血管通透性；干濕比法測肺的含水量。
　　結果：HE染色見傷肺肺泡腔內大量滲出液體和紅細胞的滲出聚集，肺泡隔增厚、斷裂、融合，大量白細胞滲出、聚集，毛細血管擴張充血。對側肺組織肺泡腔內液體滲出、紅細胞聚集，肺泡隔內白血病浸潤，毛細血

3、管擴張充血。傷后12小時、24小時、48小時和72小時血清中TNF-α和IL-8含量均高于致傷前(p<0.05)。傷后24小時以后各時間點，肺組織含水量均有明顯升高(p<0.05)，持續(xù)至72小時。肺組織伊文思藍漏出率隨著時間的發(fā)展升高(p<0.05)。血管內皮細胞膜Cx40染色較傷前減弱，OD值顯著減小(p<0.05)，并與伊文思藍漏出率呈負相關（γ=-0.934,P<0.05,γ2=0.8723）。
　　實驗二.急性肺損傷兔肺

4、微血管內皮細胞通透性改變與Cx40的關系研究
　　目的：觀察離體培養(yǎng)的兔肺微血管內皮細胞通透性改變與Cx40表達、GJC功能之間的關系。
　　方法：組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)兔肺微血管內皮細胞。細胞分為三組，對照組、創(chuàng)傷血清處理組和阻滯劑組。在阻滯劑組，細胞間隙連接通道阻滯劑1-庚醇（0.5mM）加入到培養(yǎng)液中。1小時后，阻滯劑組和創(chuàng)傷血清組的20％胎牛血清的培養(yǎng)液均被更換為含有20％創(chuàng)傷血清的培養(yǎng)液。對照組則只更換培養(yǎng)液。三組

5、細胞繼續(xù)孵育6小時后，進入實驗觀察。分別做劃痕實驗、Cx40蛋白免疫印跡和單層細胞通透性檢測。
　　結果：培養(yǎng)的內皮細胞融合成單層，呈典型的鋪路石樣鑲嵌狀排列。Cx40蛋白印跡見創(chuàng)傷血清組與阻滯劑組蛋白表達水平較對照組有明顯降低，且兩組之間亦不同，阻滯劑組蛋白水平較創(chuàng)傷血清組低（對照組為1±0.07，創(chuàng)傷血清組為0.55±0.15，阻滯劑組為0.43±0.13，n=4，p<0.05）。三組細胞劃痕邊緣的細胞均被染料LY染色，LY在

6、對照組細胞擴散得最遠，顯色的周邊細胞的數(shù)量最多，創(chuàng)傷血清組次之，阻滯劑組顯色的細胞數(shù)量最少。相鄰細胞與邊緣細胞的比值的差異具有統(tǒng)計學意義（23±5，11±3ver7±2，n=4，p<0.05）。
　　三組細胞伊文思藍清除率均隨著時間的延長而增加，且三組細胞間亦有不同，阻滯劑組清除率高于創(chuàng)傷血清組和對照組。組間差別和時間點差別均有顯著性差異。
　　實驗三：急性肺損傷兔肺微血管內皮細胞Cx40對細胞內Ca++濃度的影響研究

7、>　　目的：觀察急性肺損傷時離體培養(yǎng)的兔肺微血管內皮細胞Cx40與內皮細胞損傷、細胞內Ca++濃度變化之間的關系。
　　方法：兔肺微血管內皮細胞的培養(yǎng)和分組同實驗二。三組細胞繼續(xù)孵育6小時后，提取培養(yǎng)液測定LDH含量，加入fluo-3AM負載檢測細胞內Ca++鈣濃度。
　　結果：通過共聚焦顯微鏡的觀察，三組細胞熒光強度不相同，阻滯劑組熒光最強，對照組最弱。創(chuàng)傷血清組和阻滯劑組細胞內Ca++濃度均顯著高于對照組，(nmol/L

8、,494.8±41.94,569.8±6.70versus158.8±13.09,p<0.05)。創(chuàng)傷血清組和阻滯劑組細胞培養(yǎng)液中LDH含量均顯著高于對照組(IU/L,165.88±16.17,186.4±24.91versus51.31±13.27,p<0.05)，且血清組與阻滯劑組之間的差別亦有統(tǒng)計學意義。此外，三組細胞內Ca++含量與培養(yǎng)液中LDH的濃度還存在正相關關系(γ=0.997,p<0.05,γ2=0.994)。
　

9、　結論：
　　1.在動物實驗中，肺組織通透性升高與肺組織微血管內皮細胞Cx40表達呈負相關關系。在離體培養(yǎng)的肺微血管內皮細胞，富含炎癥介質的創(chuàng)傷血清能夠抑制Cx40的水平和GJC的功能，與此同時肺血管內皮細胞通透性升高，二者存在負相關關系，Cx40水平和GJC功能的下降能夠明顯增加肺微血管內皮細胞的通透性。
　　2.創(chuàng)傷因素所致的Cx40水平和GJC功能的抑制，與內皮細胞胞漿內Ca++濃度和和細胞損傷是負相關關系。