燒傷延遲復(fù)蘇后免疫功能障礙早期識別和防治的研究.pdf

1、目的： 1.探討燒傷延遲復(fù)蘇時CD14+單核細胞HLA-DR表達率和外周血淋巴細胞凋亡率的變化及其與膿毒癥和炎癥介質(zhì)的關(guān)系。 2.探討胸腺肽α1和卡巴膽堿對脂多糖刺激后人血CD14+單核細胞HLA-DR表達率及淋巴細胞凋亡率的影響。 3.探討卡巴膽堿對脂多糖刺激引起人血單核細胞釋放炎癥介質(zhì)的影響及其受體機制。 方法： 1.50例燒傷面積大于30％的燒傷患者，按傷后是否及時有效復(fù)蘇分為延遲復(fù)蘇組和非

2、延遲復(fù)蘇組，于傷后1、3、7、14、28 d取外周血，延遲復(fù)蘇組患者住院期間發(fā)生膿毒癥后連續(xù)兩天取外周血。20例健康體檢者外周血作為對照，流式細胞術(shù)檢測CD14+單核細胞HLA-DR表達率和外周血淋巴細胞凋亡率，ELISA法測定血漿中TNF-α和IL-10的含量。 2.分離、培養(yǎng)正常人外周血單核細胞和淋巴細胞，對照組僅加1640培養(yǎng)液，脂多糖(LPS)組加LPS刺激，LPS+卡巴膽堿組先用不同濃度卡巴膽堿(100、10、1、0.

3、1、0.01μmol/L)預(yù)處理細胞后，再加入LPS(100ng/mL)刺激，LPS+胸腺肽α1組先用不同濃度胸腺肽α1(100、10、1、0.1、0.01μg/mL)預(yù)處理細胞后，再加入LPS(100ng/mL)刺激，培養(yǎng)12h后用流式細胞儀檢測CD14+單核細胞HLA-DR表達率和外周血淋巴細胞凋亡率。 3.取6例正常獻血員外周血，密度梯度離心法分離單個核細胞，再利用單核細胞的貼壁性，分離獲得單核細胞。用含10％胎牛血清的1

4、640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞濃度為2×105/ml，加入包被了特異性捕獲抗體的96孔板。實驗分為6組：①空白對照組(C組)：85μl細胞+15μl1640；②LPS單獨刺激組(L組)：85μl細胞+5μl LPS+10μl1640；③卡巴膽堿預(yù)處理組(K組)：85μl細胞+5μl卡巴膽堿+5μl LPS+5μl1640；④阿托品+卡巴膽堿預(yù)處理組(A+K組)：85μl細胞+5μl阿托品+5μl卡巴膽堿+5μl LPS；⑤α-Bgt+卡巴膽

5、堿組預(yù)處理組(α-Bgt+K組)：85μl細胞+5μlα-Bgt+5μl卡巴膽堿+5μl LPS；⑥煙堿預(yù)處理組(N組)：85μl細胞+5μl煙堿+5μl LPS+5μl1640。K組和N組的處理過程為加入卡巴膽堿或煙堿5μl，室溫下靜置5min；加入LPS5μl。A+K組和α-Bgt+K組則在加入卡巴膽堿前5min加入阿托品或僅α-Bgt5μL；L組僅加LPS和1640培養(yǎng)液，C組僅加1640培養(yǎng)液。在整個反應(yīng)體系中各試劑終濃度分別為

6、LPS0.1μg/ml，卡巴膽堿和煙堿100gmol/L，阿托品1mmol/L，α-Bgt2μg/ml，K組預(yù)先用100、10、1、0.1，0.01μmol/L五個濃度組進行試驗并采用最佳濃度100μmol/L進行機制探討研究。所采用濃度參照文獻[1]及預(yù)實驗結(jié)果。檢測TNF-α和IL-6時，細胞在37℃、5％CO2及95％空氣、飽和濕度的CO2孵箱孵育12h，檢測IL-10時孵育20h。洗去細胞，加入生物素標記的TNF-α、IL-6、

7、IL-10檢測抗體，經(jīng)鏈酶親和素藕聯(lián)的辣根過氧化物酶催化底物顯色后，效應(yīng)細胞即單核細胞所在位置會留下約10-20μm大小的斑點，一個斑點就代表一個細胞，斑點的大小可以反應(yīng)每個細胞釋放介質(zhì)的多少。通過斑點計數(shù)可以確定分泌TNF-α、IL-6、IL-10的細胞數(shù)，寬點，總密度是斑點總面積占整個孔底面積的百分比，表示細胞因子的濃度。處理完畢后經(jīng)全自動免疫斑點圖像分析儀分析檢測。 結(jié)果： 1.燒傷患者外周血CD14+單核細胞HL

8、A-DR表達率明顯低于健康對照組(P＜0.01)，延遲復(fù)蘇患者明顯低于非延遲復(fù)蘇患者(P＜0.01或P＜0.05)，發(fā)生膿毒癥時CD14+單核細胞HLA-DR.表達率基本都在10％以下，明顯低于健康體檢者及非膿毒癥患者傷后1、7、14、28 d(P＜0.01)。燒傷患者外周血淋巴細胞凋亡率明顯高于健康對照組(P＜0.05)，延遲復(fù)蘇患者明顯高于非延遲復(fù)蘇患者，差異在傷后3d和28d有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，膿毒癥發(fā)生后外周血淋巴細胞

9、凋亡率基本都在15％以上，明顯高于健康體檢者及非膿毒癥患者傷后各天(P＜0.01)。延遲復(fù)蘇組TNF-α檢出率高于非延遲復(fù)蘇組及對照組，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，檢出樣本中TNF-α含量亦高于非延遲復(fù)蘇組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。延遲復(fù)蘇組膿毒癥發(fā)生時TNF-α檢出率和檢出樣本中的TNF-α含量均高于非膿毒癥組血液標本和正常對照組(P＜0.05或P＜0.01)。外周血CD14+單核細胞HLA-DR表達率與IL-10水平呈負相關(guān)，在傷后

10、1、7、28天有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 2.LPS單獨刺激單核細胞時，其HLA-DR表達率明顯降低，用卡巴膽堿或胸腺肽α1預(yù)處理后，HLA-DR表達率隨著卡巴膽堿或胸腺肽α1濃度的增高而增高。LPS單獨刺激淋巴細胞時，淋巴細胞凋亡率明顯增加，而用卡巴膽堿或胸腺肽α1預(yù)處理后，淋巴細胞凋亡率隨著卡巴膽堿和胸腺肽α1濃度的增高而降低。 3.LPS單獨刺激單核細胞時，TNF-α、IL-6、IL-10含量較對照組明顯升高(

11、P＜0.01)。用卡巴膽堿或煙堿預(yù)處理細胞后，TNF-α、IL-6含量明顯下降，與LPS單獨刺激組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但IL-10含量則無明顯變化?？ò湍憠A在0.01-100μmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著卡巴膽堿濃度的增加，其對LPS刺激下單核細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6的抑制作用也越明顯。阿托品預(yù)處理細胞后，卡巴膽堿對LPS刺激下單核細胞釋放TNF-α、IL-6的抑制作用無明顯變化，而α-銀環(huán)蛇毒素預(yù)處理細胞后，卡巴膽堿

12、對TNF-α、IL-6的抑制作用明顯減弱。 結(jié)論： 1.燒傷延遲復(fù)蘇患者免疫功能低下，膿毒癥患者則更為嚴重。外周血CD14+單核細胞HLA-DR表達率和淋巴細胞凋亡率可以作為動態(tài)檢測患者的免疫功能狀態(tài)的有效指標，CD14+單核細胞HLA-DR表達率低于10％，外周血淋巴細胞凋亡率高于15％對膿毒癥的發(fā)生具有預(yù)警意義。 2.燒傷延遲復(fù)蘇患者體內(nèi)炎癥介質(zhì)釋放增加，抑炎介質(zhì)IL-10對HLA-DR的表達具有抑制作用。