RAPD技術(shù)對我國11株并殖吸蟲的遺傳變異初步探討.pdf

1、目的: 自1879年，Ringer在臺灣從一具葡萄牙水手尸體肺臟內(nèi)首次檢出并殖吸蟲，至今人類研究已經(jīng)有120多年的歷史。并殖吸蟲種類很多，世界各地報道達50多種（含種、亞種、變種和同種異名等），廣泛分布于東亞、東南亞、非洲和拉丁美洲等國家，在我國并殖吸蟲報道有30種之多（含種、亞種、變種和同種異名等），分布于全國各地，尤其在江南、西南和東北各省山區(qū)等地。并殖吸蟲種類命名存在如同種異名、種名錯定等諸多問題，主要與60年代以前單一以傳統(tǒng)形態(tài)

2、學(xué)為依據(jù)和60~80年代并殖吸蟲分類研究中的一點浮躁表現(xiàn)有關(guān)。因此澄清并殖吸蟲的分類學(xué)地位，不僅對充實與修訂并殖吸蟲分類學(xué)有理論意義，而且尚可為并殖吸蟲的臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和流行病學(xué)監(jiān)控與制定防治策略提供參考。90年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于物種的遺傳變異和分類，直接從DNA水平反映基因本身，具有優(yōu)越性。因此，傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)方法分類是目前被普遍接受的一種分類方式。本實驗結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和RAPD技術(shù)對我國湖北、江西、浙江

3、等地的11株并殖吸蟲進行研究，以了解其遺傳變異情況，為并殖吸蟲分類提供依據(jù)，尤其對湖北省并殖吸蟲流行區(qū)劃分提供分子生物學(xué)依據(jù)。此外，探討采用不同蟲期標(biāo)本（成蟲和囊蚴）及其不同保存方法(10％福爾馬林或-20℃冷藏)對該研究的影響。 材料與方法: 收集我國湖北省咸寧市溫泉區(qū)、江西省武寧縣、浙江省紹興蘭亭鄉(xiāng)、湖北省赤壁市趙李橋鎮(zhèn)、湖北省十堰市區(qū)、湖北省五峰縣、湖北省鶴峰縣五里鎮(zhèn)、湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)、湖北省神農(nóng)架林區(qū)3省9地的11株并

4、殖吸蟲。其中湖北省咸寧市溫泉區(qū)、江西省武寧縣、浙江省紹興蘭亭鄉(xiāng)和湖北十堰市區(qū)4地的標(biāo)本為成蟲，依地名分別稱：湖北溫泉、江西武寧、浙江蘭亭、湖北十堰；其余5地標(biāo)本為囊蚴，其中在五峰縣和鶴峰縣走馬鎮(zhèn)的同一淡水蟹發(fā)現(xiàn)有大小兩種囊蚴，依據(jù)大小分別稱五峰(a)、五峰(b)、走馬(a)、走馬(b)，余3株依地名分別稱：湖北赤壁、湖北五里、湖北神農(nóng)架。 1.外形觀察：肉眼觀察成蟲外形，體視顯微鏡觀察囊蚴的形態(tài)并作記錄。 2. DNA提

5、?。翰扇〔煌椒ㄌ崛〔煌瑯?biāo)本基因組DNA。 3.RAPD-PCR技術(shù)：分別擴增上述并殖吸蟲的基因組DNA，根據(jù)擴增的結(jié)果，計算各株并殖吸蟲間的遺傳距離和相似系數(shù)，并采用SPSS11.0軟件的Between-groups linkage法對所得二元數(shù)據(jù)進行聚類分析，繪制系統(tǒng)進化樹。 結(jié)果: 1.外形觀察：成蟲湖北十堰株呈長梭形，湖北溫泉、江西武寧和浙江蘭亭等3株呈橢圓形；囊蚴呈圓形或類圓形，囊壁兩層，排泄囊內(nèi)含黑色

6、顆粒，鑒定為并殖吸蟲囊蚴。其中湖北赤壁株內(nèi)壁較厚；五峰(a)、五峰(b)、走馬(a)、走馬(b)和五里等5株內(nèi)壁較薄；湖北神農(nóng)架株，囊蚴形態(tài)因故已有些變形，但可以確定為并殖吸蟲囊蚴。 2.DNA提取：DNA溶液A260/A280值經(jīng)測定在1.60～2.00之間，純度符合要求。 3.RAPD-PCR：①各株間差異湖北溫泉、江西武寧、浙江蘭亭和湖北赤壁4株遺傳距離在0.1034～0.1930；湖北走馬(a)、湖北走馬(b)、

7、湖北五峰(a)、湖北五峰(b)、湖北十堰和湖北五里等鄂西6株遺傳距離在0.1233～0.3000，其中湖北走馬2株擴增帶型具有較大相似性，相似系數(shù)為0.8182，遺傳距離為0.1818，湖北五峰2株擴增帶型也具有較大相似性，相似系數(shù)0.8767，遺傳距離僅為0.1233。湖北神農(nóng)架株與各株遺傳距離在0.2329～0.4154，其與湖北溫泉、江西武寧、浙江蘭亭和湖北赤壁4株遺傳距離在0.3333～0.4154，與余6株遺傳距離在0.232

8、9～0.3731。②系統(tǒng)進化樹在SPSS構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中11株并殖吸蟲分為3類:江西武寧、浙江蘭亭、湖北溫泉和湖北赤壁等株為一類；湖北走馬(a)、湖北走馬(b)、湖北五峰(a)、湖北五峰(b)、湖北十堰和湖北五里等株為一類；湖北神農(nóng)架株為另一類。 4.湖北省主要有兩個并殖吸蟲流行區(qū):以衛(wèi)氏并殖吸蟲為主的鄂東南區(qū)；以斯氏并殖吸蟲為主的鄂西區(qū)。 結(jié)論: 1.根據(jù)RAPD-PCR的實驗結(jié)果，3省11株并殖吸蟲在基因水