肝癌中BMI-1基因的克隆及其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用.pdf

1、BMI-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1)屬于PcG(Polycomb group)家族，它與該家族其他成員如RING1，HPC2，Mph2等結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，作用于染色質(zhì)PREs(for Polycomb Response Elements)位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)組蛋白進(jìn)行乙?；腿ヒ阴；揎?，從而穩(wěn)定抑制CDKN2A轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖并

2、抑制細(xì)胞凋亡。已有大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，BMI-1對(duì)促進(jìn)腫瘤的形成和增殖起著非常重要的作用。近幾年，在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)BMI-1高表達(dá)，如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)管細(xì)胞瘤，結(jié)腸癌等。2003年Lessard報(bào)道了BMI-1在維持白血病干細(xì)胞增殖能力方面起到關(guān)鍵性作用。目前已認(rèn)為BMI-1是一種癌基因。 2004年新加坡國(guó)立大學(xué)Soek Ying Neo等人用基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)伴有HB

3、V感染的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者肝癌組織中.BMI-1的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高。但目前對(duì)BMI-1在原發(fā)性肝癌形成和發(fā)展中的作用尚不甚了解。由于原代建立的人正常成體肝臟上皮細(xì)胞生存時(shí)間多在2周內(nèi)，難以長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，因此通過(guò)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1的人正常成體肝臟上皮細(xì)胞來(lái)研究BMI-1對(duì)肝癌發(fā)生和發(fā)展作用的實(shí)驗(yàn)方法存在一定困難。而HaCaT細(xì)胞是一種來(lái)源于人正常成體皮膚角質(zhì)細(xì)胞，體外培養(yǎng)自發(fā)永生化的細(xì)胞系。該細(xì)胞系可無(wú)限傳代，長(zhǎng)期保持表型和

4、基因型的穩(wěn)定性，并且始終保持非腫瘤特性。因此，HaCaT細(xì)胞系是體外研究基因改變誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的良好模型。所以，本研究選擇將人肝癌組織中克隆出的BMI-1基因?qū)際aCaT細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)BMI-1的HaCaT、細(xì)胞系，從而探討人肝癌組織中高表達(dá)的BMI-1誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用和可能的分子機(jī)制。進(jìn)而推測(cè)BMI-1基因可能在人原發(fā)性肝癌的發(fā)生中起到一定的作用。 本研究采用RT-PCR的方法在RNA水平首次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了

5、BMI-1在人原發(fā)性肝癌組織和Huh7，HepG2，7420，SMMC四種建系的肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，而人正常肝臟組織中不表達(dá)BMI-1。并采用RT-PCR的方法從人肝癌組織中克隆出BMI-1 cDNA序列，將其定向克隆到pcDNA3.0載體，構(gòu)建成pcDNA3.0-BMI-1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染：HaCaT細(xì)胞，通過(guò)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)BMI-1的HaCaT單克隆細(xì)胞系，用RT-PCR及Western Blot分別在RNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行鑒

6、定。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)方式，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，克隆形成率，軟瓊脂實(shí)驗(yàn)和SCID鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)BMI-1的HaCaT細(xì)胞核質(zhì)比明顯增高，成團(tuán)生長(zhǎng)，增殖能力和克隆形成能力顯著提高，細(xì)胞無(wú)停泊依賴性，SCID鼠皮下移植致瘤，說(shuō)明BMI-1基因誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。通過(guò)定量PCR的方法對(duì)惡性轉(zhuǎn)化后HaCaT細(xì)胞中p14ARF，p16，CCND1，CDKNlA，CCNE1，CCNA2，CDKN2C，CDKN1C的RNA轉(zhuǎn)

7、錄水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表達(dá).BMI-1后INK4 α-ARF轉(zhuǎn)錄受到明顯抑制，其下游調(diào)控的細(xì)胞周期蛋白及周期蛋白依賴性激酶的轉(zhuǎn)錄水平相應(yīng)升高，說(shuō)明 BMI-1誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能分子機(jī)制是抑制了INK4 α-ARF的轉(zhuǎn)錄。本研究首次發(fā)現(xiàn)了人肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)BMI-1基因，首次從人肝癌組織中克隆出BMI-1基因，首次將克隆的BMI-1基因?qū)際aCaT細(xì)胞誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并首次提出其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞惡性