脂氧素A4對(duì)子癇前期大鼠的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景:
　　 子癇前期（preeclampsia）是最常見的妊娠期并發(fā)癥之一，是孕產(chǎn)婦和圍生兒病率及死亡率的主要原因，嚴(yán)重影響母嬰健康。但是，到目前為止該病仍沒有確切有效的治療辦法。子癇前期的病因目前還不是很清楚，比較公認(rèn)的是由于“胎盤的淺著床”導(dǎo)致胎盤缺血缺氧，從而使巨大發(fā)生了過度炎癥反應(yīng)，許多炎癥因子從胎盤釋放到母體血液循環(huán)中，與母體的血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，從而引起子癇前期的相關(guān)癥狀。
　　 脂氧素(l

2、ipoxin，LX)被形象地稱為炎癥反應(yīng)的“剎車信號(hào)”，通過跨細(xì)胞途徑由花生四烯酸(arachidonic acid)合成，它具有抗炎和促炎癥消退，但又不損傷機(jī)體的正常生理功能的獨(dú)特藥理作用。近年來，脂氧素在許多炎癥相關(guān)疾病的治療研究中取得了重要進(jìn)展，這也為我們預(yù)防和治療子癇前期提供了新思路和理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用子癇前期大鼠模型，研究LXA4類似物BML-111對(duì)子癇前期臨床癥狀高血壓和蛋白

3、尿的影響，研究BML-111對(duì)子癇前期胎盤和腎臟病理改變、全身和胎盤部位炎癥反應(yīng)的影響。體外實(shí)驗(yàn)，研究LXA4對(duì)LPS刺激的人早孕期絨毛外層滋養(yǎng)細(xì)胞株(TEV-1)的增殖、凋亡和炎癥因子產(chǎn)生的影響及其機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過向大鼠尾靜脈注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立起子癇前期大鼠模型，腹腔注射BML-111進(jìn)行治療，用BP-98A血壓儀測(cè)量大鼠血壓的變化，BCA蛋白分

4、析試劑盒檢測(cè)蛋白尿改變，HE染色法觀察胎盤和腎臟病理變化，ELISA和RT-PCR法分別檢測(cè)血液和胎盤中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)水平的改變。體外實(shí)驗(yàn)，采用LPS刺激TEV-1細(xì)胞以模擬炎癥微環(huán)境，用MTT法觀察LXA4對(duì)TEV-1細(xì)胞增殖的影響，用Annexin V和PI雙標(biāo)的流式細(xì)胞檢測(cè)法和Western blot法觀察LXA4對(duì)TEV-1細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，用ELISA法和RT-PCR法檢測(cè)

5、LXA4對(duì)TNF-α和IL-8水平的影響，用Hoechst染色、免疫熒光法和Western blot法觀察LXA4對(duì)NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.BML-111能緩解LPS誘導(dǎo)的子癇前期大鼠的臨床癥狀
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給妊娠第14天的孕鼠注射1μg/kg LPS后，在妊娠第16天、18天和20天收縮壓明顯升高并高于control組(p＜0.05)。從妊娠第14天起向LPS

6、注射過的孕鼠每天腹腔注射1 mg/kg BML-111，連續(xù)6天，在妊娠第18天和20天能明顯地降低收縮壓(p＜0.05)。在妊娠第12天，注射LPS前，control組和LPS組孕鼠的24 h蛋白尿水平?jīng)]有顯著性差異，但在妊娠第19天，LPS組24 h蛋白尿水平高于control組(p＜0.05)。和LPS組相比，BML-111能降低妊娠第19天子癇前期大鼠的24 h蛋白尿水平(p＜0.05）。
　　 2.BML-111能減輕

7、LPS誘導(dǎo)的子癇前期大鼠的胎盤和腎臟的病理損傷
　　 LPS造成的胎盤和腎臟的病理損傷表現(xiàn)為胎盤毛細(xì)血管壁增厚，和腎小球硬化并伴有炎癥細(xì)胞聚集。上述病理損傷能有效地被BML-111緩解。
　　 3.BML-111能抑制LPS誘導(dǎo)的子癇前期大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-8的產(chǎn)生ELISA結(jié)果表明，相比于control組，妊娠第20天LPS組大鼠血清中的TNF-α和IL-8水平明顯升高(p＜0.05），用BML-111連續(xù)治療6

8、天能降低子癇前期大鼠血清中TNF-α和IL-8的水平(p＜0.05)。同時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示妊娠第20天LPS組胎盤中TNF-α和IL-8基因表達(dá)明顯強(qiáng)于control組，相比于LPS組，LPS+BML-111組兩者基因表達(dá)減弱。
　　 4.LXA4促進(jìn)LPS刺激的TEV-1細(xì)胞增殖
　　 用不同濃度的LPS刺激TEV-1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率以濃度依賴的方式下降。LXA4以濃度依賴的方式增加LPS刺激的TEV-

9、1細(xì)胞存活率，當(dāng)LXA4濃度為200 nM時(shí)，細(xì)胞的存活率達(dá)到高峰。
　　 5.LXA4抑制LPS刺激的TEV-1細(xì)胞凋亡
　　 用1μg/ml的LPS刺激TEV-1細(xì)胞24h后，LPS組細(xì)胞的凋亡率升高到19.1±2.9％，明顯高于control組的4.6±1.0％(p＜0.05)。用200nM濃度的LXA4預(yù)處理LPS刺激的細(xì)胞后，能將凋亡率降至8.9±1.6％(p＜0.05，和LPS組相比較)。結(jié)果還顯示，LXA4

10、的這種抑制凋亡作用會(huì)部分地被10μM濃度的LXA4受體阻斷劑Boc-2阻斷。Western blot結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白在control組細(xì)胞中都有表達(dá)，和control組相比，LPS能下調(diào)Bcl-2蛋白水平，上調(diào)Bax蛋白水平，LXA4能抑制LPS對(duì)這兩種蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)，Boc-2能部分阻斷LXA4的作用。
　　 6.LXA4抑制LPS刺激的TEV-1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-8
　　 RT-PC

11、R結(jié)果顯示，用1μg/ml LPS刺激TEV-1細(xì)胞24h導(dǎo)致TNF-α和IL-8mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(p＜0.05，和control組相比較)，而用200nM濃度的LXA4預(yù)處理LPS刺激的細(xì)胞后能減弱兩者的表達(dá)(p＜0.05，和LPS組相比較)。同時(shí)，10μM Boc-2能部分阻斷LXA4的作用(p＜0.05，和LPS+LXA4組相比較)。ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，LPS刺激后導(dǎo)致細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-8水平升高(p＜0.05，和

12、control組相比較)，而用LXA4預(yù)處理LPS刺激的細(xì)胞后能明顯降低這兩種炎癥因子的水平(p＜0.05，和LPS組相比較)，Boc-2能部分阻斷LXA4的作用(p＜0.05，和LPS+LXA4組相比較)。
　　 7.LXA4抑制LPS刺激的TEV-1細(xì)胞NF-κB激活和核轉(zhuǎn)位
　　 免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，NF-κB p65主要存在于control組細(xì)胞的胞漿內(nèi)，用LPS刺激細(xì)胞24h后，NF-κB p65大部分轉(zhuǎn)位到細(xì)胞

13、核內(nèi)。如果先用LXA4預(yù)處理LPS刺激的TEV-1細(xì)胞，這種核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象就會(huì)被明顯抑制，而Boc-2能部分阻斷LXA4的作用。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，LPS刺激會(huì)導(dǎo)致胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)減弱胞漿NF-κB p65和IκB-α蛋白表達(dá)，而用LXA4預(yù)處理LPS刺激的TEV-1細(xì)胞后就能抑制LPS的這些作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1.BML-111能降低子癇前期大鼠的收縮壓和蛋白尿，減輕胎盤和