兔VX2肺種植瘤放療前后CT灌注成像參數(shù)變化及CT灌注成像參數(shù)與VEGF和MMP-2表達(dá)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在很多城市發(fā)病率已居首位。早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療仍然是目前臨床工作重點(diǎn)。臨床上常以CT檢查作為監(jiān)測(cè)放療療效的影像手段，但常規(guī)CT掃描作為一種形態(tài)學(xué)影像檢查方法并不能很好地反映放療前后腫瘤內(nèi)部的血流動(dòng)力學(xué)變化，而這對(duì)放療前靶區(qū)勾畫、治療計(jì)劃的制定及放療后后續(xù)治療方案的制定有著十分重要的臨床意義。人們已經(jīng)開(kāi)始探索應(yīng)用CT灌注成像評(píng)估腫瘤放療療效。本研究在建立兔VX2肺種植瘤模型的基礎(chǔ)上，就CT灌注成像參數(shù)與腫

2、瘤微血管密度及VEGF和MMP-2表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行研究。觀察兔VX2肺種植瘤放療前后CT灌注成像參數(shù)變化、腫瘤大小變化及腫瘤微血管密度變化，并就三者相互間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行研究，以期為CT灌注成像成為肺部腫瘤放療過(guò)程中療效評(píng)估及預(yù)后判斷中新的影像學(xué)手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法: 1、設(shè)備、主要試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及VX2細(xì)胞系來(lái)源美國(guó)GE雙排CT，GE lightspeed Ultra 16排螺旋CT掃描設(shè)備，AW4.1工作站

3、Perfusion3軟件，放療采用美國(guó)瓦里安公司2100C/D直線加速器。 新西蘭大白兔，體重(2.5±0.5)kg，雌雄不分，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。VX2鱗癌細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院介入放射科實(shí)驗(yàn)室提供。 2、實(shí)驗(yàn)方案 實(shí)驗(yàn)分為三部分第一部分采用懸液注射法、手術(shù)法和穿刺種植腫瘤法建立兔VX2肺種植瘤模型，觀察不同模型實(shí)驗(yàn)兔生長(zhǎng)情況，比較三種方法優(yōu)缺點(diǎn)，找到一種相對(duì)理想的模型建立方法。 第

4、二部分入組11只實(shí)驗(yàn)兔，測(cè)定實(shí)驗(yàn)兔CT灌注參數(shù)及相應(yīng)的VEGF和MMP-2及MVD計(jì)數(shù)情況，探討三者相互間的相關(guān)性。 第三部分實(shí)驗(yàn)首先探討放療后和自然情況下實(shí)驗(yàn)兔的CT灌注參數(shù)變化規(guī)律，放療組入組4只實(shí)驗(yàn)兔，觀察組入組5只實(shí)驗(yàn)兔，放療組在治療當(dāng)天及放療后第1、3、5、7、9、11及第13天分別行CT灌注檢查，觀察組也在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)行CT灌注檢查，根據(jù)放療后CT灌注參數(shù)變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的觀察時(shí)間點(diǎn)。

5、3、實(shí)驗(yàn)方法 (1)CT平掃檢查實(shí)驗(yàn)兔種植一周后，每?jī)商鞕z查一次。采用GE lightspeed Ultral 16螺旋CT。實(shí)驗(yàn)兔應(yīng)用3必戊巴比妥鈉溶液麻醉后，仰臥位固定于自制的固定架上，放于CT掃描床，定位掃描后，行胸腔平掃。 (2)CT灌注及增強(qiáng)檢查實(shí)驗(yàn)兔腫瘤長(zhǎng)到7mm以上時(shí)，采用美國(guó)GE lightspeed Ultral 16螺旋CT掃描設(shè)備。將實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定于自制的固定架上，3％(1ml/kg)戊巴比妥鈉麻

6、醉，待麻醉成功，呼吸平穩(wěn)后(呼吸節(jié)律控制在13～15次/分)，先行平掃，確定的腫瘤部位和范圍，然后選擇腫瘤組織中心層面，對(duì)腫瘤行多層同層動(dòng)態(tài)灌注掃描。采用24GA一次性靜脈留置針經(jīng)耳緣靜脈穿刺后，連接高壓注射器靜脈快速團(tuán)注。 在CT灌注掃描后5小時(shí)，再按上述流速注射相同劑量的造影劑，同CT平掃條件做CT增強(qiáng)掃描。 (3)CT灌注圖像后處理及分析將CT灌注圖像傳到AW4.1工作站，應(yīng)用GE公司的Perfusion 3.0軟

7、件包進(jìn)行計(jì)算，使其生成對(duì)指定類型的定量函數(shù)圖和灌注參數(shù)，使用電影循環(huán)功能，快速連續(xù)顯示圖像。標(biāo)識(shí)胸主動(dòng)脈作為輸入動(dòng)脈，尺寸按2～6個(gè)象素放置，以避免部分容積效應(yīng)問(wèn)題。 (4)三維立體適形放療治療計(jì)劃的制定及實(shí)施待實(shí)驗(yàn)兔VX2肺種植瘤長(zhǎng)到7mm以上，用3％(1ml/kg)戊巴比妥鈉麻醉后將實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定于自制的固定架上，行CT定位。CT定位采用美國(guó)GElightspeed Ultra 16排螺旋CT掃描設(shè)備，掃描完成后將CT圖像

8、傳送到放射治療工作站上，勾畫靶區(qū)。 (5)組織學(xué)檢查及結(jié)果判定CT灌注掃描后1小時(shí)內(nèi)處死實(shí)驗(yàn)兔，兔肺標(biāo)本常規(guī)用10％中性福爾馬林脫水，石蠟固定，4 μm厚切片(組織切片與CT所選層面一致)。行HE染色及免疫組化檢查。 微血管密度(microvaseular densiry，MVD)計(jì)數(shù)：MVD定義為單位面積組織切片內(nèi)CD34染色陽(yáng)性的微血管細(xì)胞數(shù)。腫瘤內(nèi)孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞族代表1條單獨(dú)的微血管。 VE

9、GF免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判斷：腫瘤細(xì)胞胞漿、胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見(jiàn)到陽(yáng)性染色，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，取其平均值。 MMP-2免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判斷：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)、血管內(nèi)皮或間質(zhì)中出現(xiàn)棕、黃色顆粒或團(tuán)塊。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，最后取其平均值。胞質(zhì)內(nèi)無(wú)棕黃色顆粒的細(xì)胞為MMP-2陰性細(xì)胞。 (

10、6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS12 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包做分析處理，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。不同組別之間的參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson法。p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01被認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、VX2腫瘤種植后實(shí)驗(yàn)兔生長(zhǎng)情況種植后10天～20天，實(shí)驗(yàn)兔開(kāi)始出現(xiàn)厭食，精神不振，活動(dòng)，覓食減少，毛發(fā)光澤度下降。 懸液注射法肺成瘤率為100％(13/1

11、3)，種植后三周觀察，胸膜、膈肌及肺門淋巴結(jié)均有腫瘤生長(zhǎng)，肺內(nèi)腫瘤數(shù)量為5～15個(gè)。平均生存時(shí)間為(38±3)d。手術(shù)法成肺瘤率為64.3％(9/14)，種植后三周觀察，肺門淋巴結(jié)有腫瘤生長(zhǎng)，肺內(nèi)僅出現(xiàn)1個(gè)腫瘤。實(shí)驗(yàn)兔平均生存時(shí)間為(46±5)d。 穿刺種植腫瘤法肺成瘤率為84.6％(11/13)，種植后三周觀察，肺門淋巴結(jié)有腫瘤生長(zhǎng)，肺內(nèi)僅出現(xiàn)1個(gè)腫瘤。實(shí)驗(yàn)兔平均生存時(shí)間為(54±5)d。 與懸液注射法相比，手術(shù)法和穿

12、刺種植腫瘤法實(shí)驗(yàn)兔生存期明顯延長(zhǎng)。與手術(shù)法相比，穿刺種植腫瘤法種植成功率明顯提高，實(shí)驗(yàn)兔生存期亦明顯延長(zhǎng)。 2、CT平掃和增強(qiáng)掃描結(jié)果CT平掃腫瘤呈橢圓形或不規(guī)則形，CT值：43.27±5.59Hu。增強(qiáng)CT見(jiàn)腫瘤多呈均勻強(qiáng)化，CT值：112.27±22.78Hu，其中3例腫瘤直徑大于11mm值，腫瘤內(nèi)有壞死，造成不均勻強(qiáng)化。 3、CT灌注檢查結(jié)果兔VX2肺種植瘤CT灌注圖像質(zhì)量良好，在BF和BV圖中瘤區(qū)血供極豐富，在偽

13、彩圖上為紅色。瘤周區(qū)血供較正常肺組織也有所升高，為紅色。PS圖顯示病變最清楚，瘤區(qū)PS值有明顯升高，在偽彩圖上為紅色，瘤周區(qū)PS值較正常肺組織升高，但較腫瘤區(qū)為低，在偽彩圖上為綠色。PS圖上顯示的病變范圍與CT增強(qiáng)圖像顯示的病變范圍近似，而B(niǎo)F和BV圖上顯示的病變范圍比CT增強(qiáng)圖像顯示的病變范圍要大。 4、CT灌注參數(shù)與MMP-2，VEGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)相互間的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析表明：腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)CT灌注參數(shù)MAV

14、、BF、BV和PS與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)；腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)CT灌注參數(shù)MAV、BF、BV和PS與MVD呈正相關(guān)；MVD與VEGF表達(dá)亦呈正相關(guān)；腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)PS值與MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)；MVD及VEGF表達(dá)與MMP-2表達(dá)無(wú)相關(guān)性。 5、放療對(duì)CT灌注參數(shù)、腫瘤大小及MVD變化的影響治療組實(shí)驗(yàn)兔放療后1周和非治療組實(shí)驗(yàn)兔單純飼養(yǎng)1周后相比，腫瘤大小具有顯著差異，治療組實(shí)驗(yàn)兔腫瘤明顯小于非治療組，P<0.01。治療組實(shí)驗(yàn)兔放療后1周與非

15、治療組實(shí)驗(yàn)兔單純飼養(yǎng)后1周相比，治療組實(shí)驗(yàn)兔瘤區(qū)BF、BV、MAV值和PS值均明顯低于非治療組，P值均小于0.01，有顯著差異。 治療組放療1周后所測(cè)的MVD計(jì)數(shù)為48±9，非治療組在單純飼養(yǎng)1周后所測(cè)的MVD計(jì)數(shù)為73±8，兩者存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01。 Pearson相關(guān)分析表明：放療與否腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)BF、BV和MAV值變化與MVD計(jì)數(shù)變化呈正相關(guān)，P<0.05，放療與否腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)PS變化與MVD計(jì)數(shù)變化無(wú)相關(guān)

16、性；放療與否腫瘤大小變化和MVD計(jì)數(shù)變化，BF值和MAV值變化與腫瘤大小變化亦呈正相關(guān)，放療與否腫瘤大小變化與PS和BV值變化無(wú)相關(guān)性。 結(jié)論: 1．與懸液注射法和手術(shù)法相比，穿刺種植腫瘤法建立的兔VX2肺種植瘤模型更為穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)兔生存時(shí)間更長(zhǎng)，更有利于實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。我們認(rèn)為穿刺種植腫瘤法建立的兔VX2肺種植瘤模型能夠?yàn)榉尾磕[瘤診治提供穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。 2．CT灌注參數(shù)不僅能反映兔VX2肺種植瘤微血管生

17、成情況，而且可反映VEGF和MMP-2表達(dá)情況，表明VEGF和MMP-2在兔VX2肺種植瘤微血管生成和轉(zhuǎn)移播散中發(fā)揮了重要作用。 3．兔VX2肺種植瘤經(jīng)X刀治療后，免疫組化CD34染色觀測(cè)腫瘤MVD較非治療組明顯減少。與非治療組相比，瘤區(qū)CT灌注參數(shù)BF、BV、PS和MAV值均下降，做BF、BV和MAV值變化與腫瘤MVD變化的相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果均顯示出相關(guān)性。表明CT灌注參數(shù)BF、BV和MAV值可作為與組織學(xué)MVD相對(duì)應(yīng)的，一種活