CLM3和CLM5促進TOLL樣受體(TLR)觸發(fā)巨噬細胞天然免疫應(yīng)答反應(yīng)及其相關(guān)分子機制的研究.pdf

1、免疫識別與免疫調(diào)節(jié)的細胞與分子機制是當前免疫學(xué)研究的重要領(lǐng)域。天然免疫系統(tǒng)是機體抗細菌、病毒等病原體入侵的“第一道防線”，而TOLL樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)以及表達TLRs的巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞是天然免疫的重要的組成部分，有關(guān)TLR參與巨噬細胞免疫識別的機制以及觸發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)節(jié)機制、特別是對于TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機制尚不十分清楚，因此，參與TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新的分子機制的

2、研究備受矚目。 作為機體重要的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRR)，TLRs主要表達于免疫細胞包括樹突細胞、巨噬細胞和中性粒細胞、淋巴細胞表面。TLRs通過識別表達在細菌、病毒和真菌組成物上廣譜的病原體相關(guān)分子模式，啟動宿主抗感染的天然免疫反應(yīng)。識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)后，TLRs招募胞漿內(nèi)一系列

3、含有TIR區(qū)域的接頭蛋白，如MyD88、TIRAP(又稱作IAL)、Trif(又稱作TICAM1)和TRAM(又稱作TICAM2)。除TLR3外，TLRs家族的所有成員都可以通過MyD88依賴途徑活化，MyD88可通過活化下游的MAPKs和NF-κB來調(diào)控炎性細胞因子的分泌。TLR3和TLR4可通過活化TRIF依賴的途徑活化NF-κB，MAPKs和IRF3，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6和IFNβ等細胞因子。TLRs信號過度活化或

4、負向調(diào)控不足會導(dǎo)致嚴重的免疫相關(guān)性疾病和炎癥性疾病，如果活化不足將導(dǎo)致嚴重的免疫缺陷。目前已發(fā)現(xiàn)的一些正向調(diào)控因子，如DC-SIGN、Ras等，和負向調(diào)控因子，如A20、SHP-1、ST2等，為維持TLRs介導(dǎo)的免疫應(yīng)答穩(wěn)定性發(fā)揮了重要的作用。由于TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對天然免疫及獲得性免疫均具有重要的調(diào)節(jié)作用，TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究對于闡明機體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的機理、尋找免疫調(diào)節(jié)治療的新途徑具有重要意義，因此TLRs參與免疫識別與免疫調(diào)節(jié)的

5、機制研究是當前免疫學(xué)研究的前沿熱點。 我們研究的CLM家族分子，其最早發(fā)現(xiàn)是源于CMRF35-A單抗識別的一個淋巴細胞表面抗原，該抗原分子屬于IgSF超家族成員，含有單鏈的免疫球蛋白可變區(qū)的胞外段，跨膜段和胞內(nèi)段，基因定位于人17號染色體。后來證明，此抗CMRF-35的單克隆抗體還能識別CMRF-35分子的同源分子，這些分子結(jié)構(gòu)與CMRF-35相似，可變區(qū)與CMRF-35同源，在17號染色體上成簇分布(cluster)因而命名為

6、CD300家族。其相應(yīng)的小鼠同源分子命名為CLM(CMRF-35-Like Molecule，CLM)家族。鼠CMRF35樣分子超家族含有9個成員，位于鼠第11號染色體上，CLM1-8非常緊密地位于11E2區(qū)的250kb左右的區(qū)域，而CLM9與其他家族成員分離，位于11D區(qū)。CLM家族成員與免疫應(yīng)答、炎癥及變態(tài)反應(yīng)關(guān)系密切，首先，CLM家族成員主要表達在參與固有免疫應(yīng)答的髓系免疫細胞表面，有些成員如CLM4在脾臟等免疫器官高表達，還有如

7、CLM5在與外來抗原直接接觸的氣道和肺臟高表達；其次，多數(shù)活化性受體成員如CLM5、CLM7、CLM8在抗體交聯(lián)活化后能促進中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞或嗜堿性粒細胞分泌炎性因子，而抑制性受體成員如CLM1或CLM8則抑制炎性反應(yīng)或免疫細胞應(yīng)答：再次，許多受體成員如CLM1/5，CLM4/8，在炎癥因子等外來刺激的細胞表面表達發(fā)生變化，提示在炎癥反應(yīng)過程中起一定的正向和負向調(diào)控作用。CLM分子參與TLRs免疫識別與應(yīng)答的調(diào)節(jié)機制是

8、值得研究的重要課題，目前基本上屬于空白點。 CLM3作為CLM家族的成員，其特征和功能都沒有相關(guān)報道，本研究中我們從小鼠腹腔巨噬細胞中成功克隆了CLM3的全長基因，長738bp堿基，編碼245個氨基酸(a．a(chǎn))的蛋白質(zhì)，推測分子量為27kDa。對其氨基酸序列分析表明，該蛋白含有長17a．a(chǎn)的信號肽和22a．a(chǎn)的疏水跨膜區(qū)，胞外段含有特征性的IgV功能域(domain)，屬于Ig超家族成員，CLM3定位于小鼠11號染色體的11E

9、2區(qū)，CLM1-8非常緊密地位于該區(qū)，而CLM9與其他家族成員分離。同源性比對發(fā)現(xiàn)與CLM3同源性較高的均為CLM家族成員，其中與CLM5和CLM1同源性最高，胞外段一致性為85％。 RT-PCR分析表明，CLM3廣泛分布于小鼠正常組織，在心、肝、脾及淋巴結(jié)等組織均有不同程度表達，其中尤以淋巴結(jié)表達水平最高，在P815、Crip、RF、CT26、YAC-1、A20、3LL、Hepa、RAW264.7等細胞株中，CLM3僅在RA

10、W264.7巨噬細胞株中表達，在新鮮分離的小鼠原代的細胞中，亦驗證了此結(jié)果，CLM3僅在腹腔巨噬細胞中表達，這種在組織細胞的分布特點提示該分子在免疫防御中可能的功能。 由于許多炎性因子可以通過影響具有調(diào)控功能的分子的表達進而調(diào)控細胞的應(yīng)答，因此我們在本研究中觀察了TLRs配體LPS、polyⅠ：C、CpG ODN對CLM3分子表達的影響，然而LPS(0.1μg/ml劑量刺激)、polyⅠ：C(0.1μg/ml劑量刺激)、CpG

11、ODN(0.3μM劑量刺激)刺激至24小時，Raw264.7細胞中CLM3 mRNA的表達無明顯變化。 CLM3究竟有何功能?是否同其他CLM家族成員一樣在免疫與炎癥中發(fā)揮重要作用?是否也參與了TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)? 我們發(fā)現(xiàn)，CLM3能促進CpG ODN誘導(dǎo)的炎性細胞因子(TNFα和IL6)的產(chǎn)生。我們將CLM3 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細胞48小時，CpG ODN(0.3μM劑量刺激)刺激6小時后，收集上清采用EL

12、ISA試劑盒測定TNF-α和IL-6表達。結(jié)果顯示，CLM3表達被干擾后，CpG ODN誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6產(chǎn)生降低。將CLM3全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，操作步驟同上，結(jié)果顯示，過表達CLM3后，CpG ODN誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6產(chǎn)生增加。其它TLR配體如LPS刺激無明顯變化。該結(jié)果證明CLM3參與并促進了TLR9觸發(fā)的巨噬細胞的炎癥反應(yīng)過程。 CLM3促進了TLR9觸發(fā)的巨噬細胞的炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制如

13、何?我們將MyD88、IRAK1、TRAF6、CLM3質(zhì)粒與TNF-α報告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，24小時后檢測TNF-α報告基因活化情況。結(jié)果顯示，CLM3過表達增強了MyD88、IRAK1、TRAF6誘導(dǎo)的TNF-α活化；同時，我們應(yīng)用TRIF、TAK1、CLM3質(zhì)粒與TNF-α報告基因共轉(zhuǎn)染HEK293，24小時后檢測TNF-α報告基因活化情況。結(jié)果顯示，CLM3過表達對TRIF、TAK1誘導(dǎo)的TNF-α活化沒有顯著影響。提示

14、CLM3能通過MyD88、IRAK1、TRAF6途徑促進TLR9的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)免疫共沉淀實驗結(jié)果證實，CLM3通過與MyD88結(jié)合來促進后者的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示CLM3可能通過促進IRAK1和TRAF6或TRAF6和TAK1復(fù)合物的形成來促進TLR9的信號傳遞。 我們又檢測了MAPK及NF-κB的活化情況，將CLM3全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，24小時后以CpG ODN刺激，觀察MAPK的磷酸化及NF-κB的．p65亞基的入核

15、情況。應(yīng)用CpG ODN刺激過表達CLM3的巨噬細胞后，JNK、ERK的磷酸化增加，NF-κB的P65亞基較對照組入核增加，提示CLM3通過活化MAPK和NF-κB來調(diào)控細胞因子的產(chǎn)生。 綜上所述，我們克隆了屬于CLM家族的CLM3分子并對其的生物學(xué)特性及功能進行了研究。CLM3主要在小鼠腹腔巨噬細胞中表達，能促進CpG ODN刺激的腹腔巨噬細胞炎性細胞因子的分泌，免疫共沉淀證實CLM3通過與MyD88結(jié)合來促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且CL

16、M3增強了CpG ODN誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB的活化。本課題探討了CLM3對TLR9通路的細胞因子產(chǎn)生的影響并初步研究了其作用機制，為免疫識別以及抗感染治療提供了一條新的途徑。 綜上所述，我們對CLM家族的CLM5的生物學(xué)特性及功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)CLM5主要在小鼠腹腔巨噬細胞中表達，干擾CLM5表達之后能夠降低TLRs配體刺激的腹腔巨噬細胞IFN-βand IL6的分泌，經(jīng)VSV刺激后IFN-β產(chǎn)生也降低。進一步研究表明C