人巨細胞病毒誘導CHRF-288-11細胞凋亡的分子機制.pdf

1、本研究在原有的工作基礎上，將進一步對HCMV引起血小板減少癥的分子機制進行闡明。 研究材料：材料CHRF-288-11細胞株由香港中文大學兒科系實驗室提供。HCMVAD169株由中國武漢病毒研究所提供，效價為10-6TCD50/ml。批號為20040625。 研究方法：CHRF-288-11細胞株用含10％FBS、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的MeM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，每周換液2次，

2、傳代1次。取對數(shù)增殖期細胞作實驗。HCMV原液直接感染CHRF細胞株。使其終濃度分別為原液的1/10000即10-4、1/1000即10-3、3/1000即3×10-3和1/100即10-2，并設立空白對照組。用RT-PCR觀察鑒定HCMV是否能直接感染CHRF細胞株；用MTT法檢測各實驗組的細胞存活率；用Hoechst核染色、DNA片段瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞儀分析細胞亞二倍體峰等進行分析HCMV感染CHRF細胞株后誘導凋亡的特征；用

3、Western-Blotting免疫印跡和各種特異性的阻斷劑分析HCMV介導凋亡的信號機制。 研究結(jié)果： 1.HCMV能直接感染CHRF細胞RT-PCR擴增特異IE基因，擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳，通過紫外凝膠成像，各HCMV感染組均可見一條特異性擴增條帶，而空白對照組未見陽性條帶。 2.HCMV誘導CHRF細胞生長抑制和凋亡體外培養(yǎng)CHRF細胞經(jīng)10-2HCMV直接感染后，用MTT，PI單染流式細胞，Ho

4、echst33258核染色等方法于HCMV感染后的第2天、第4天和第6天分別檢測。 檢測結(jié)果表明：感染后時間依賴性地細胞存活率顯著降低，G1期前的亞二倍體峰(凋亡率)顯著增加，細胞核固縮核碎裂現(xiàn)象增加。在相同培養(yǎng)條件下，用10-4、10-3和10-2濃度的HCMV感染CHRF細胞，于感染后第4天用MTT，PI單染流式細胞，Hoechst33258核染色和DNA凝膠電泳等法檢測。檢測結(jié)果表明：HCMV濃度依賴性地降低CHRF細胞存

5、活率，增加CHRF細胞的凋亡率，誘導CHRF細胞核固縮核碎裂增加，DNA梯樣條帶。 3.Caspase-3的激活參與HCMVAD169株誘導的CHRF細胞凋亡CHRF感染組CHRF細胞內(nèi)總caspase-3(35kd)量逐漸減少，而活化態(tài)的caspase-3片段(19或17KD)顯著增加。Caspase-3特異抑制劑Z-VAD-FMK在HCMV感染CHRF細胞后12h加入處理組，于感染后第4天用MTT法檢測細胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)c

6、aspase-3特異抑制劑Z-VAD-FMK抑制HCMV降低的CHRF細胞存活率。 4.抑制ERK通路介導HCMV抑制CHRF細胞的增殖用10-2HCMV感染CHRF細胞，于指定的時間收集各時間點的蛋白，用Westernblotting檢測，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，HCMV處理組隨著感染時間延長ERK1/2磷酸化水平逐漸降低；用ERK通路的特異抑制劑PD98059加入CHRF細胞，顯示其可抑制ERK1/2磷酸化水平；該過程中

7、ERK1/2蛋白總量不變。同時，PD98059可降低CHRF細胞存活率。 5.激活c-Jun通路介導HCMV誘導的CHRF細胞的凋亡用10-2HCMV感染CHRF細胞后，于指定的時間收集各時間點的蛋白，用Westernblotting檢測，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，HCMV感染組隨著感染時間延長CHRF細胞內(nèi)p-c-Jun和c-Jun逐漸增加；用JNK特異抑制劑SP600125可抑制HCMV增加的p-c-Jun和c-Jun蛋白

8、水平。同時，SP600125抑制HCMV降低的CHRF細胞存活率。 研究結(jié)論： 1.HCMVAD169株直接感染CHRF細胞并降低其存活率。 2.HCMVAD169株可以誘導典型的CHRF細胞的凋亡。 3.Caspase-3的激活參與HCMVAD169株誘導的CHRF細胞凋亡。 4.HCMV抑制ERK通路的活性可能是其抑制CHRF細胞增殖的主要分子基礎。 5.激活c-Jun通路的活性可能是