維生素D3抑制Runt相關轉錄因子3依賴的結腸癌細胞增殖的研究.pdf

1、背景:結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前居惡性腫瘤發(fā)病率第四位，預計在我國結直腸癌發(fā)病率上升的趨勢還將進一步發(fā)展。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，維生素D在預防和減少結腸癌的發(fā)病率和死亡率中發(fā)揮重要的作用。作為一種潛在的抗腫瘤藥物，維生素D3具有廣闊的臨床應用前景。因此，深刻理解維生素D3的抗腫瘤作用機制對臨床的有效應用尤為重要。研究表明，通過下調TGF-β信號通路而抑制細胞生長和誘導凋亡是維生素D3抗腫瘤增殖的重要作

2、用機制。而Runx3蛋白是TGF-β信號轉導通路下游的關鍵因子,Runx3蛋白的失活使得TGF-β信號通路發(fā)生紊亂，從而導致腫瘤的發(fā)生。其中，Runx3是Runt 結構域轉錄因子(Runx1、Runx2和Runx3)家族成員之一，是一種新型的抑癌基因；在胃癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等中都發(fā)現(xiàn)有不同程度的轉錄失活或表達下調。研究表明，結腸癌組織中Runx3表達明顯低于正常組織，恢復結腸癌細胞中Runx3的活性，可以抑制腫瘤細胞的生

3、長和轉移。鑒于共同的信號轉導通路，維生素D3的抗腫瘤作用機制是否與Runx3的表達有關尚無研究報道。而且，已有研究證實，維生素D3對 Runt家族所有轉錄因子都有調控作用，可以激活髓細胞中Runx1和HL-60白血病細胞中Runx3的表達，抑制成骨細胞中Runx2的表達。那么，在結腸癌細胞中維生素D3是否對Runx3的表達有誘導作用？因此，本課題將對維生素D3對結腸癌細胞中Runx3的表達影響及其機制進行探討。
　　 目的:

4、r>　　 1、明確維生素D3的抗結腸癌細胞增殖作用與上調Runx3的表達是否相關；
　　 2、探討維生素D3上調Runx3表達的可能機制。
　　 方法:
　　 1、利用western blot檢測結腸癌細胞系中Runx3的表達；
　　 2、利用RT-PCR和western blot分別檢測不同濃度的維生素D3作用及相同濃度的維生素D3作用不同時間段后結腸癌細胞中Runx3 mRNA和蛋白表達水平的變化；

5、
　　 3、基因重組的方法構建含有Runx3特異性siRNA的表達載體；
　　 4、siRNA轉染結腸癌細胞SW480，經G418篩選獲得穩(wěn)定低表達的細胞系；
　　 5、MTT法和流式細胞術檢測維生素D3對轉染前后的細胞生長作用的影響；
　　 6、Western blot檢測cyclin A，cyclin D1，cyclin E，cdk2，cdk4，PCNA，Rb and p27蛋白水平的表達變化。

6、>　　 結果:
　　 1、結腸癌細胞中Runx3的表達情況對結腸癌細胞系Runx3的表達進行western blot檢測結果顯示：Lovo細胞Runx3表達缺失；HT-29、SW620細胞系中Runx3有微弱表達。SW480細胞系Runx3表達水平相對較高。
　　 2、維生素D3誘導SW480細胞Runx3基因表達的時間和劑量依賴性增加利用RT-PCR技術檢測經不同濃度維生素D3作用后SW480結腸癌細胞中Runx3基

7、因mRNA表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)未經藥物處理的細胞中Runx3基因低表達，分別用10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L的維生素D3作用后，細胞中Runx3 mRNA的表達量逐漸增加，具有明顯的劑量依賴性。Western blot結果顯示細胞中Runx3在蛋白表達水平也呈劑量依賴性增加，與RT-PCR結果一致。其中，維生素D3的作用濃度為10-8mol/L時，Runx3的表達已明顯增加，我們以此濃度進行后續(xù)實驗。
　　

8、 10-8mol/L的維生素D3作用于SW480結腸癌細胞，western blot檢測作用不同時間后(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)Runx3蛋白表達水平。結果顯示，隨著維生素D3作用時間的推移，Runx3蛋白的表達量逐漸增加，其中在72h達高峰。
　　 3、維生素D3通過誘導Runx3表達抑制結腸癌細胞的增殖成功構建了含有Runx3 特異性siRNA的表達質粒Runx3-si。選取結腸癌細胞SW480(表達

9、中等強度Runx3)進行轉染。經G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉染的結腸癌細胞系：SW480-siRNA和SW480-vector。RT-PCR和western blot檢測驗證，Runx3-si轉染細胞后能顯著抑制Runx3的表達。轉染空載體對Runx3的表達無影響，進而獲得穩(wěn)定轉染的敲除Runx3的結腸癌細胞系。
　　 細胞生長曲線結果顯示，維生素D3作用后，SW480-siRNA細胞的生長速度顯著快于對照組SW480-vect

10、or和SW480細胞，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05),而對對照組SW480-vector和SW480細胞的生長抑制作用無統(tǒng)計學差異。Runx3基因敲除后，維生素D3的抑制作用不明顯，SW480-siRNA加藥前后生長速度無明顯差異。流式細胞術分析結果顯示，抑制Runx3基因表達后，維生素D3的抑制增殖作用減弱，細胞生長數(shù)明顯增多、速度加快，G1期比例顯著減少(p＜0.05)。
　　 4、Runx3可以通過調節(jié)cyclin A，

11、cyclin D1，cyclin E，cdk2，cdk4，PCNA，Rb和p27等周期相關分子的表達影響細胞周期進展western blot結果顯示，Runx3 特異性siRNA能上調結腸癌細胞中cyclin A，cyclin D1,cyclin E,cdk2,cdk4和PCNA蛋白的表達，而下調Rb和p27蛋白的表達。維生素D3對細胞周期蛋白的影響為：抑制cyclin A,cyclin D1,cyclin E，cdk2，cdk4和PC

12、NA的表達，而刺激Rb和p27蛋白的表達。然而，維生素D3對Runx3基因敲除細胞中的細胞相關分子的表達影響較小。
　　 結論:
　　 本研究揭示了維生素D3通過誘導抑癌基因 Runx3的表達上調而抑制結腸癌細胞增殖的證據(jù)，同時，我們發(fā)現(xiàn)Runx3 特異性siRNA能上調cyclin A，cyclin D1,cyclin E,cdk2,cdk4，p-Rb和PCNA蛋白的表達，而下調Rb和p27蛋白的表達，從而影響細胞周期