LPS作用RL95-2細(xì)胞β-1,4-GalT-I表達(dá)變化及與MAPK信號(hào)通路相關(guān)性研究.pdf

1、目的:細(xì)胞中β-1，4-半乳糖及轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ（β-1，4-GalT-Ⅰ）可發(fā)揮糖基轉(zhuǎn)移酶及細(xì)胞識(shí)別和黏附作用，參與腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移、神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)、精卵識(shí)別與結(jié)合過(guò)程。LPS（Lipopolysaccharides，脂多糖）具有活化巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等作用，產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。研究表明LPS可明顯上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)黏附分子如ICAM-1（細(xì)胞間黏附分子）、PECAM-1（血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子）、黏附分子CD11b等的表達(dá)

2、。MAPKs（絲裂原激活蛋白激酶）有四個(gè)亞族ERK1/2、p38-MAPKMAPK、JNK、ERK5中ERK1/2和ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，JNK和p38-MAPK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子CREB為p38-MAPK和ERK信號(hào)途徑下游的靶分子，其磷酸化后可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究擬通過(guò)檢測(cè)LPS作用后RL95-2細(xì)胞中β-1，4-GalT-Ⅰ的表達(dá)變化，以及CREB對(duì)

3、β-1，4-GalT-Ⅰ表達(dá)變化的調(diào)控作用，探究MAPK信號(hào)通路與LPS影響β-1，4-GalT-Ⅰ表達(dá)作用機(jī)制的相關(guān)性。
　　方法:MTT法檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)RL95-2細(xì)胞活力的影響;將RL95-2細(xì)胞分空白組、正常對(duì)照組、LPS時(shí)間(0、2、4、6、8h)及濃度(0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml)梯度組培養(yǎng)，RT-PCR、Western Blot檢測(cè)LPS對(duì)RL95-2細(xì)胞β-1，4-Ga

4、lT-Ⅰ表達(dá)影響;選擇LPS作用的最適條件作用RL95-2細(xì)胞，WesternBlot檢測(cè)MAKPs通路中ERK1/2、p38-MAPK分子及下游靶分子CREB的磷酸化程度變化;以CREB干擾序列轉(zhuǎn)染RL95-2細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)β1，4-GalT-Ⅰ的表達(dá)差異;以p38-MAPK抑制劑SB203580、ERK1/2抑制劑U0126分別作用于RL95-2細(xì)胞，分析對(duì)β-1，4-GalT-Ⅰ表達(dá)影響及與CREB磷酸化變化的

5、相關(guān)性。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果顯示LPS對(duì)RL95-2細(xì)胞活力有明顯抑制作用，與空白組對(duì)比，濃度1000μg/mlLPS培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)胞活力明顯抑制(p＜0.05)，培養(yǎng)48 h時(shí)，除1μg/ml和10μg/ml外，其他濃度也表現(xiàn)為細(xì)胞活力明顯抑制(p＜0.01); LPS作用后RL95-2細(xì)胞中β-1，4-GalT-Ⅰ表達(dá)升高，且呈時(shí)間、劑量-效應(yīng)的依賴關(guān)系。在LPS濃度100μg/ml作用時(shí)間4h時(shí)β-1，4-GalT-Ⅰ在

6、基因水平表達(dá)達(dá)到最大值(p＜0.05)，在LPS濃度100μg/ml作用6h時(shí)β-1，4-GalT-Ⅰ在蛋白水平表達(dá)達(dá)到最大值(p＜0.01); LPS可上調(diào)RL9-52細(xì)胞中CREB的磷酸化程度(p＜0.05)、p38的磷酸化程度(p＜0.05)及ERK1/2磷酸化程度(p＜0.01); Western Blot結(jié)果顯示設(shè)計(jì)的CREB序列都對(duì)RL95-2細(xì)胞CREB表達(dá)產(chǎn)生了干擾作用(p＜0.01);WesternBlot檢測(cè)干擾RL

7、95-2細(xì)胞CREB表達(dá)后β-1，4-GalT-Ⅰ表達(dá)降低(p＜0.01);以p38-MAPK抑制劑SB203580及ERK1/2抑制劑U0126RL95-2細(xì)胞，聯(lián)合LPS作用檢測(cè)到CREB磷酸化程度及β-1，4-GalT-Ⅰ的表達(dá)升高不明顯(p＜0.05)。
　　結(jié)論:LPS作用RL95-2細(xì)胞會(huì)使其表面的β-1，4-GalT-Ⅰ表達(dá)升高，同時(shí)會(huì)使CREB、p38-MAPK、ERK1/2磷酸化水平升高;MAPK信號(hào)通路中p38