基于thyA基因的染色體-質粒平衡致死系統(tǒng)的構建.pdf

1、目前，外源基因表達載體多以抗生素抗性基因作為選擇標記，對于基因治療和基因免疫用表達載體，這些抗性標記基因的存在有可能引起一系列生物安全性問題。因此，需用更為安全的非抗生素抗性標記表達載體，其中染色體．質粒平衡致死系統(tǒng)具有廣泛的應用前景。 為了構建用于動物基因治療和基因免疫的非抗性標記表達載體，我們將DH5a大腸桿菌在含有胸腺嘧啶核苷和3-甲氧2-氨嘧啶的CBT培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)，篩選得ThyA-突變株21株。這些突變株在不含胸

2、腺嘧啶核苷的CB瓊脂平板上不生長，只有在添加胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基或轉化thyA表達載體后才能在正常培養(yǎng)基生長。為了研究thyA基因突變的分子機理，用高保真PCR法克隆4個突變株的thyA基因，序列分析結果顯示，4、7、13號菌株在70位堿基起有6個堿基缺失，導致25位甘氨酸和26位蘇氨酸的缺失；6號突變株在92位堿基由G突變?yōu)锳，導致31位甘氨酸被天冬氨酸替換。用PCR克隆野生大腸桿菌的ThyA基因，將其克隆入原核表達載體，用重組大腸桿

3、菌表達的重組蛋白免疫小鼠，用獲得的抗血清進行免疫轉印試驗，結果發(fā)現突變株的ThyA基因仍能表達。 根據鼠傷寒沙門氏菌菌株thyA基因序列設計一對引物，用PCR擴增包括啟動子的thyA基因，將序列正確的基因取代表達人溶菌酶基因的真核載體pcDNAKYZ中的卡那抗性基因，獲得非抗性選擇標記表達載體pDTALYZ。將其轉化ThyADH5a大腸桿菌，轉化菌涂布不含胸腺嘧啶核苷的CB平板，篩選得非抗性標記重組大腸桿菌。在CBt液體培養(yǎng)基傳