克倫特羅單克隆抗體制備和殘留ELISA檢測(cè)方法及試劑盒研究.pdf

1、克倫特羅(CL)是一種β-興奮劑，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料利用率，改善瘦肉率的作用。但該藥排泄速率慢，易蓄積在動(dòng)物組織中，引起消費(fèi)者發(fā)生急性中毒，目前已被大多數(shù)國(guó)家列為禁用藥。然而，CL濫用和殘留問(wèn)題仍然存在，靈敏、有效的殘留檢測(cè)方法是控制殘留的基本手段。 為建立更加靈敏、實(shí)用的CL快速篩選方法，開(kāi)發(fā)試劑盒，有效監(jiān)測(cè)動(dòng)物源食品中CL殘留，本研究對(duì)已有單克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇、篩選和亞克隆，體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體。通過(guò)優(yōu)化間接

2、競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ciELISA)條件，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。豬、牛尿液調(diào)pH＞8.0，經(jīng)叔丁基甲醚提取后檢測(cè)，肝臟用鹽酸水解，再用0.5mol/LKH2PO4提取，過(guò)C18柱凈化，用ciELISA檢測(cè)，建立了豬、牛尿液和肝臟中CL殘留ELISA快速檢測(cè)方法。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)、與儀器方法的比對(duì)試驗(yàn)及與國(guó)外試劑盒的比較試驗(yàn)對(duì)建立的方法進(jìn)行了考核。 研究中建立細(xì)胞株C61123/246B3和C61123/246A5，制備C61123/246B3抗

3、體，效價(jià)為1：64000，特異性良好，與其它藥物的交叉反應(yīng)性均低于10％。 ciELISA最佳反應(yīng)條件為：抗原包被濃度0.5μg/mLCL，抗體工作濃度1：32000，37℃競(jìng)爭(zhēng)約60min，酶標(biāo)二抗(羊抗小鼠HRP-IgG)稀釋濃度1：5000。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=-25.306x+54.105(r=-0.9907)，檢測(cè)的線性范圍為0.1～27ng/mL，IC50(50％抑制濃度)平均為1.8ng/mL，最低檢測(cè)限(L

4、OD)達(dá)0.1ng/mL。豬尿、牛尿和豬肝中LOD均為0.3ng/mL，牛肝中的LOD為0.5ng/mL。豬尿和牛尿中添加CL0.3、1、2ng/mL，回收率為63.82±13.93％～111.94±7.41％，變異系數(shù)小于20％。豬肝臟中添加CL0.3、1、2ng/g，回收率為80.45±13.79％～98.45±16.99％，牛肝中添加CL0.5、1、2ng/g，回收率為82.58±15.88％～92.86±18.37％，變異系數(shù)均

5、小于20％。 用該方法檢測(cè)喂藥(2mg/kg)豬尿液和肝臟樣品，結(jié)果證明，該方法可特異性檢測(cè)實(shí)際樣品中殘留CL。本方法與GC-MS同時(shí)分析添加CL的牛肝樣品，結(jié)果表明，兩種方法分析結(jié)果相關(guān)系數(shù)r=0.99，表明本方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。 本試劑盒與國(guó)外試劑盒最低檢測(cè)限均為0.1ng/mL，IC50高于國(guó)外試劑盒的IC50(1.04ng/mL)。自制試劑盒和國(guó)外試劑盒檢測(cè)的線性范圍分別為0.1～27ng/mL和0.2～8.

6、1ng/mL，板內(nèi)變異系數(shù)分別小于9.22％和8.77％，樣品添加回收率分別為98.5％～112.5％和107.3％～122.4％。表明本試劑盒檢測(cè)線性范圍比國(guó)外同類(lèi)試劑盒更寬，對(duì)組織中CL檢測(cè)的特異性?xún)?yōu)于國(guó)外試劑盒，半定量比國(guó)外試劑盒更準(zhǔn)確。 本研究方法符合歐盟動(dòng)物源食品中藥物殘留方法性能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)低限與國(guó)內(nèi)外試劑盒水平相當(dāng)，特異性和準(zhǔn)確度更高，可作為動(dòng)物尿液和組織中CL殘留篩選方法，為有效監(jiān)測(cè)CL濫用和殘留提供可靠的檢測(cè)