黑曲霉耐熱β-葡萄糖苷酶的分離純化及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又被稱作纖維二糖(cellobiase，EC3.2.1.21)，被認(rèn)為是纖維素酶水解的限速酶。獲得熱穩(wěn)定性好，酶比活力高，產(chǎn)量大的β-葡萄糖苷酶，一直是研究纖維素酶的焦點(diǎn)問題。
　　黑曲霉3.316分泌的β-葡萄糖苷酶具有良好耐熱性質(zhì)，本研究以β-葡萄糖苷酶為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵液的粗提條件進(jìn)行了優(yōu)化，分離純化了β-葡萄糖苷酶，研究了β-葡萄糖苷酶對(duì)乙醇溶液和聚乙二醇(PEG)溶液的耐受性

2、并運(yùn)用生物信息手段對(duì)其活性位點(diǎn)和耐熱機(jī)理進(jìn)行了探究。主要結(jié)果如下:
　　1.通過硫酸銨分級(jí)沉淀、乙醇分級(jí)沉淀、PEG分級(jí)沉淀及超濾對(duì)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液的粗提條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳粗提條件是:50％乙醇沉淀和超濾結(jié)合。
　　2.黑曲霉3.316發(fā)酵粗酶液經(jīng)過粗提后，利用AKTA Purifier100全自動(dòng)層析儀進(jìn)行離子交換和凝膠過濾分離純化β-葡萄糖苷酶，通過SDS-PAGE電泳測(cè)定其亞基分子量為60 kDa。
　　

3、3.通過測(cè)定β-葡萄糖苷酶在濃度分別為10％～80％的乙醇溶液和10％～90％的PEG溶液中，預(yù)處理時(shí)間分別為10～60 min內(nèi)其活性的變化，探究β-葡萄糖苷酶對(duì)兩種溶劑的耐受性，結(jié)果顯示:不同預(yù)處理時(shí)間之間、不同乙醇/PEG反應(yīng)濃度之間及不同預(yù)處理時(shí)間和不同乙醇/PEG反應(yīng)濃度之間的交互作用均差異顯著，β-葡萄糖苷酶在預(yù)處理時(shí)間40 min50％濃度的乙醇和在預(yù)處理時(shí)間30min20％濃度的PEG具有良好的耐受性，酶活分別為0.51

4、1 U/mg和0.852 U/mg。
　　4.提取黑曲霉3.316的基因組DNA，以其為模板利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到大小為2080 bp的bgl基因，并對(duì)其核苷酸和氨基酸序列以及可能編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，根據(jù)其結(jié)構(gòu)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其活性位點(diǎn)和耐熱機(jī)理進(jìn)行探究。結(jié)果表明該蛋白可能含860個(gè)氨基酸殘基，存在4個(gè)主要疏水區(qū)，最大疏水得分為1.343;其二級(jí)結(jié)構(gòu)可能含有63.26％的無規(guī)則卷曲，20.58％α-螺旋，16.16％β-折

5、疊;利用NCBI CDD對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域:（β/α）8TIM桶域、(β/α)6夾層三明治域和纖維連接蛋白的Ⅲ-like域，其中前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔擒彰讣易?，第三個(gè)功能是未知，但與前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域有連接作用;利用Blast進(jìn)行多重序列同源比對(duì)和SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)其活性位點(diǎn)和耐熱機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Asp280、Trp281、Gly294、Asn405、Pro410、和Glu509屬于高保守氨基酸殘基且位于蛋白質(zhì)活性