乙酰肝素酶反義寡核苷酸對(duì)惡性黑素瘤生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)是一種新近克隆成功的葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，也是體內(nèi)惟一能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycan．HSPG)的內(nèi)切糖苷酶，通過降解HSPG，破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜結(jié)構(gòu)，在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。目前研究證明，Hpa mRNA和蛋白在多種惡性腫瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤及惡性黑素瘤等組織中的表達(dá)異常增高，并且證實(shí)

2、其表達(dá)水平增高與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)；最新研究顯示，Hpa與卵巢癌、胃癌等腫瘤的生長(zhǎng)、增殖及凋亡亦密切相關(guān)。但是，有關(guān)Hpa對(duì)惡性黑素瘤生長(zhǎng)調(diào)控的相關(guān)研究，特別是以Hpa基因?yàn)榘悬c(diǎn)的反義寡核苷酸技術(shù)抑制惡性黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的研究，國(guó)內(nèi)外均未見文獻(xiàn)報(bào)道。 惡性黑素瘤(Malignant melanoma，MM)是一種常見的黑素細(xì)胞腫瘤，具有惡性程度高、極易發(fā)生早期侵襲和轉(zhuǎn)移以及死亡率高等臨床特點(diǎn)，在所有惡性腫瘤

3、中占1％～2％。有資料顯示，本病晚期患者的平均生存期僅為6～10月。近年來，世界范圍內(nèi)的惡性黑素瘤發(fā)病率呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。2006年最新報(bào)告顯示，黑素瘤已成為美國(guó)第7位最常見的惡性腫瘤；澳大利亞每年每10萬(wàn)人中有40～60例為新發(fā)病例； 1981年～2000年間，我國(guó)皮膚惡性黑素瘤亦有明顯增加，平均年增長(zhǎng)率達(dá)3.9％。目前，雖然在Mohs顯微外科手術(shù)、化療、放療以及免疫治療等方面進(jìn)行了大量的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，但療效常不十分理想。因此，惡性黑

4、素瘤的防治在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域始終是一個(gè)國(guó)際性的難題和研究熱點(diǎn)。近年，隨著反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)基因治療技術(shù)的飛速發(fā)展，以其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、合成容易、安全性高、特異性強(qiáng)等突出特點(diǎn)已成為腫瘤基因治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。為研究Hpa與惡性黑素瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系，探討惡性黑素瘤基因治療的有效方法，本研究應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的乙酰肝素酶反義寡核苷酸(Hpa-ASODN)下調(diào)靶基因表達(dá)的

5、治療策略，采用細(xì)胞培養(yǎng)、異種移植瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、原位雜交和免疫組織化學(xué)等多種實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)惡性黑素瘤中Hpa mRNA和蛋白的表達(dá)以及Hpa-ASODN對(duì)惡性黑素瘤腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制進(jìn)行了一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。 本研究共分三個(gè)部分。 第一部分惡性黑素瘤中乙酰肝素酶mRNA和蛋白表達(dá)的研究 目的： 觀察良、惡性黑素細(xì)胞腫瘤中Hpa mRNA和蛋白表達(dá)的差異，探討Hpa與惡性黑素

6、瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 方法： 1.采用原位雜交和免疫組織化學(xué)(SP法，AEC顯色)兩種實(shí)驗(yàn)方法在基因水平和蛋白水平上對(duì)30例惡性黑素瘤組織、人惡性黑素瘤A375細(xì)胞株、30例黑素細(xì)胞痣組織及15例正常皮膚組織中：Hpa的tuRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 2.采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行X<'2>檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。 第二部分乙酰肝素酶反義寡核苷酸體外抑制惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

7、 目的： 觀察Hpa-ASODN轉(zhuǎn)染對(duì)體外培養(yǎng)的人惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖的影響，檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞Hpa mRNA和蛋白表達(dá)的影響；篩選ASODN最佳有效序列，探討Hpa-ASODN對(duì)A375細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及可能機(jī)制，為裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.設(shè)計(jì)、合成針對(duì)ttpa mRNA的ASODN-t1、ASODN-t2、ASODN-t3、ASODN-t4 4條反義寡核苷酸鏈和1條無關(guān)寡核苷酸鏈(

8、N-ODN)，制備各自10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L濃度的寡核苷酸(ODN)陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹體，分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的惡性黑素瘤A375細(xì)胞株，以培養(yǎng)液代替ODN作為對(duì)照； 2.采用倒置相差顯微鏡和常規(guī)HE染色觀察每條鏈各濃度組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)改變；采用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖。 3.采用原位雜交與免疫組織化學(xué)(SP法，AEC顯色)兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后抑制細(xì)胞增殖最強(qiáng)序列的ASODN組(

9、30μmol/LASODN-t2)、N-ODN組及對(duì)照組3組細(xì)胞Hpa mRNA和蛋白表達(dá)水平。 4.數(shù)據(jù)用X±S表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 第三部分乙酰肝素酶反義寡核苷酸對(duì)裸鼠惡性黑素瘤移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制研究 目的： 建立Hpa-ASODN轉(zhuǎn)染的人惡性黑素瘤A375細(xì)胞異種移植瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；觀察Hpa-ASODN對(duì)裸鼠體內(nèi)人惡性黑素瘤皮下移

10、植瘤生長(zhǎng)的影響；檢測(cè)移植瘤Hpa mRNA和蛋白、VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的改變，進(jìn)一步探討Hpa-ASODN對(duì)裸鼠體內(nèi)人惡性黑素瘤移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及可能機(jī)制。 方法： 1.選擇25只雌性BALB/c裸鼠，每組5只，分為5組；分別采用10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L ASODN-t2和30μmol/L N-ODN的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人惡性黑素瘤A375細(xì)胞，用培養(yǎng)液代替ODN作為對(duì)照，以轉(zhuǎn)染細(xì)胞皮

11、下注射的方式進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，建立人惡性黑素瘤A375細(xì)胞異種移植瘤動(dòng)物模型；用游標(biāo)卡尺測(cè)量并計(jì)算移植瘤體積；6周后處死荷瘤裸鼠，HE染色觀察組織學(xué)形態(tài)。 2.采用RT-PCR、原位雜交及免疫組織化學(xué)(SP法，DAB顯色)三種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)上述5組移植瘤Hpa mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 3.采用免疫組織化學(xué)(SP法，DAB顯色)方法檢測(cè)30μmol/L ASODN-t2組、30μmol/L N-ODN組及對(duì)照組腫瘤組

12、織VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平的變化。 4.數(shù)據(jù)用X+S表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)論 1.惡性黑素瘤組織中Hpa mRNA和蛋白均呈高表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于黑素細(xì)胞痣和正常皮膚，且Hpa mRNA和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)高度一致。提示Hpa在惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要作用，有可能成為惡性黑素瘤的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)之一。 2.首次檢測(cè)了

13、惡性黑素瘤A375細(xì)胞株中Hpa mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示其Hpa mRNA和蛋白亦呈高表達(dá)，表明該細(xì)胞株可作為體內(nèi)外研究惡性黑素瘤與Hpa，關(guān)系的靶細(xì)胞系。 3．Hpa—ASODN對(duì)體外培養(yǎng)的．A375細(xì)胞增殖有抑制作用，且有濃度依賴效應(yīng)，證明Hpa—ASODN具有體外抗惡性黑素瘤的活性。 4．Hpa—ASODN可下調(diào)A375細(xì)胞Hpa mRNA和蛋白的表達(dá)，提示Hpa的表達(dá)下調(diào)可能是引起A375細(xì)胞增殖抑制作用

14、機(jī)制之一。 5．首次成功建立了A375細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，提示該裸鼠移植瘤模型可作為今后研究惡性黑素瘤與Hpa關(guān)系的動(dòng)物模型。 6．率先證實(shí)Hpa—ASODN可明顯抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，并可下調(diào)裸鼠移植瘤組織中Hpa mRNA和蛋白的表達(dá)，提示Hpa—ASODN具有體內(nèi)抗惡性黑素瘤的作用。 7．首次發(fā)現(xiàn)Hpa-ASODN可下調(diào)裸鼠移植瘤組織中VEGF和bFGF的表達(dá)，提示Hpa-ASODN可能具有抑制腫瘤血管生