IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed融合蛋白重組體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α)主要由活化的T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，具有多種不同的生物學(xué)功能。它以兩種生物活性形式存在，即26kD的跨膜型TNF-α(transmembranTNF-α,TM-TNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(secretedTNF-α，S-TNF-α)。TM-TNF-α是S-TNF-α的前體，在TNF-α轉(zhuǎn)換酶(TACE)的作用下，其胞外段被切割，脫落成S-TN

2、F-α。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，TM-TNF-α和其受體結(jié)合后，不僅可以啟動受體后的信號傳導(dǎo)，即正向信號，而且能向自身所在的細(xì)胞傳遞信號，即“反向信號”(reversesignaling)，并引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。 本室的前期實驗通過免疫共沉淀技術(shù)證實IKK-α和TRAF1分別可以與TM-TNF-α共沉淀下來，提示這兩種信號分子有可能以直接或間接的方式與TM-TNF-α的胞漿段結(jié)合，傳遞反向信號。 本實驗主要通過基因工

3、程技術(shù)從細(xì)胞中獲取IKK-α和TRAF1全長編碼基因，分別與可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光蛋白對構(gòu)建成融合蛋白，同時構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測用的陽性質(zhì)粒，為通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)一步研究它們在活體細(xì)胞內(nèi)相互之間的作用奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下： 一.IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed構(gòu)建、克隆及鑒定 1.重組體的構(gòu)建和克?。禾崛aji細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cD

4、NA為模板，用PCR擴(kuò)增IKK-α和TRAF1目的基因；通過巢式PCR進(jìn)行鑒定，以確認(rèn)擴(kuò)增片段的特異性。同時以pIRES-EGFP質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到EGFP目的基因片斷。以XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pEGFP-N3質(zhì)粒和IKK-α目的基因，以EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切pDsRed-N1質(zhì)粒和TRAF1及EGFP目的基因，并用T4DNA連接酶連接，獲得IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed及EGFP-pDsRed的重組

5、體，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑選陽性克隆。 2.陽性克隆的鑒定：以菌落PCR初步篩選陽性克隆，再用上述限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，結(jié)果顯示三種重組體經(jīng)酶切分別能得到2.2Kb、1.3Kb和720bp的目的片斷，與連接的目的基因大小一致。進(jìn)一步DNA測序分析，證實三個重組體均各包含IKK-α、TRAF1和EGFP的編碼區(qū)，沒有突變和移碼。提示IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed及EGFP-pDsRed三個重組

6、體已經(jīng)構(gòu)建成功。 二.IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDsRed、EGFP-pDsRed三個重組體在真核細(xì)胞表達(dá)與鑒定 將三種重組體分別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，可見IKK-α-pEGFP融合蛋白(綠色熒光).彌散分布在胞漿內(nèi)，TRAF1-pDsRed融合蛋白(紅色熒光)則局限在細(xì)胞亞區(qū)。而表達(dá)EGFP-pDsRed融合蛋白既能呈現(xiàn)綠色熒光，又可呈現(xiàn)紅色熒光，主要分布在胞漿內(nèi)。提示IKK-α-pEGFP、TRAF1-pDs