骨髓間充質(zhì)干細胞移植在急性肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定植能力的實驗研究.pdf

1、我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，每年有眾多的患者發(fā)展到終末期肝病、肝衰竭，目前最為理想的治療選擇為肝移植術，然而此手術存在供體的緊缺、手術侵襲性大、術后免疫排斥以及高額的治療費用等臨床和社會問題，其廣泛應用受到限制。肝細胞移植也是治療肝功能衰竭和代謝性肝臟疾病的有效方法，細胞移植治療方法日益受到人們的關注，然而也面臨肝細胞來源不足的臨床應用難題，限制了其在臨床的應用。 20世紀90年代以來興起的干細胞技術日漸成熟，成為生命科學領域的研究

2、熱點。干細胞具有極強的自我更新能力和一定的分化潛能，是組織工程和細胞治療理想的種子細胞。人體內(nèi)多種組織和器官內(nèi)存在的間充質(zhì)干細胞是目前公認的多潛能干細胞，它由中胚層發(fā)育而來，具有很強的可塑性。近年的研究證明人骨髓來源的BMSc具有向肝細胞樣細胞分化潛能，由于其取材方便、供源豐富、分離培養(yǎng)簡單、增殖迅速，并且無免疫排斥反應，易于轉(zhuǎn)染外源基因，因而有望成為肝病細胞治療和基因治療的理想細胞。 本實驗目的是①建立穩(wěn)定的大鼠骨髓間充質(zhì)干細

3、胞(bonemesenchymal stem cells，BMSCs)體外分離培養(yǎng)實驗體系；②建立大鼠急性肝衰竭動物模型；③用BrdU標記、示蹤觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在急性肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定植情況。 實驗方法： 1．BMSCs的分離培養(yǎng)，傳代和表型鑒定：取7-8周齡近交系雄性Lewis大鼠骨髓細胞，梯度密度離心法分離獲得骨髓單個核細胞；用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12低糖培養(yǎng)基，采用反復貼壁

4、法，獲得貼壁生長的BMSCs，并擴增BMSCs。流式細胞儀檢測CD34、CD90、CD29、CD45、CD54、CD11b抗原的表達。 2．5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記BMSCs 3．急性肝衰竭動物模型的制備： 用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制備大鼠急性肝衰竭模型。 4．動物實驗： (1)細胞移植：試驗分三組(A、B、C組)，經(jīng)陰囊上靜脈向肝衰竭組(A組)及肝臟正常(c組)的大鼠移植

5、標記Brdu的BMscs 1～1.5×10<'6>，同時向肝衰竭組(B組)的大鼠注射等量的生理鹽水作為移植對照。2周后觀察大鼠的存活率及肝功能恢復情況，并通過免疫組織化學方法檢測大鼠肝臟中BrdU<'+>細胞數(shù)量及分布。 (2)實驗結果：移植2周A組、B組動物存活率、肝功能恢復情況無明顯差異，肝損傷組(A組)及肝臟正常組(C組)大鼠肝臟均可檢測到BrdU<'+>細胞分布，但A組與C組相比，A組BrdU<'+>細胞數(shù)較多，分布更廣