六味地黃湯光合細(xì)菌代謝液的制備、藥理及指紋圖譜研究.pdf

1、六味地黃湯光合細(xì)菌代謝液（LW-PSB）是將優(yōu)選的光合細(xì)菌作為菌種，引入到六味地黃湯中進(jìn)行代謝，通過(guò)光合細(xì)菌的生物轉(zhuǎn)化功能和自身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的利用，制備出的六味地黃湯生物制劑，它是一種經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而形成的含有光合細(xì)菌菌體蛋白及其代謝分泌物、培養(yǎng)基和中草藥發(fā)酵物的混合物。 中藥復(fù)方所含成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用化學(xué)對(duì)照品或者對(duì)照藥材作為參比標(biāo)準(zhǔn)，試圖用這些已知的化合物來(lái)控制中藥的質(zhì)量。但是，這些已知化學(xué)成分不能全面的代表該藥物的療

2、效，一些未知的化學(xué)成分常常被認(rèn)為對(duì)藥效起重要作用，而這些未知的成分表現(xiàn)出復(fù)雜、數(shù)量巨大的特點(diǎn)。因此，傳統(tǒng)中藥質(zhì)量控制方法是一種間接的、不完全的質(zhì)量控制方法。 LW-PSB是由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓等六味傳統(tǒng)中藥和光合細(xì)菌菌液以及培養(yǎng)基制備而成的，六味藥材本身成分復(fù)雜，再加上各組分之間復(fù)雜的相互作用以及光合細(xì)菌的代謝過(guò)程，使其成分更加復(fù)雜。為了較好地控制LW-PSB的質(zhì)量，本論文制備不同代謝條件的藥液，在對(duì)其免疫

3、調(diào)節(jié)作用考察的基礎(chǔ)上，篩選出藥效最好的樣品，研究其對(duì)下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸的作用，并建立各樣品的HPLC 藥效指紋圖譜，找出與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)的化學(xué)成分，從而揭示化學(xué)信息與藥效之間的相關(guān)性，文中還對(duì)藥效相關(guān)成分的來(lái)源進(jìn)行了研究。 論文首先根據(jù)影響光合細(xì)菌生長(zhǎng)的因素，就藥液濃度、pH值、接種量、代謝時(shí)間4個(gè)因素設(shè)計(jì)了光合細(xì)菌在不同條件下代謝六味地黃湯的正交試驗(yàn)，由此制備得到了使用化學(xué)和豆?jié){兩種培養(yǎng)基代謝的18份LW-PS

4、B樣品。 之后課題組其他人員用甲狀腺素聯(lián)合利血平建立小鼠腎陰虛模型，分別給予小鼠這18份樣品，研究結(jié)果表明，LW-PSB能改善腎陰虛小鼠癥狀，增加腎陰虛小鼠的體重，并對(duì)腎陰虛小鼠脾臟的萎縮有拮抗作用，這說(shuō)明LW-PSB具有治療腎陰虛和提高機(jī)體非特異性免疫作用。其中以樣品H2、H5、H8、D1、D2、D5的藥效最好，且與傳統(tǒng)的六味地黃湯相比更具有優(yōu)勢(shì)?；瘜W(xué)培養(yǎng)基組以H2 的藥效最好，即在pH2、接種量X2、六味地黃湯濃度C1的條件

5、下以化學(xué)培養(yǎng)基代謝t2時(shí)間的藥液；豆?jié){培養(yǎng)基組以D1的藥效最好，即在pH1、接種量X1、六味地黃湯濃度C1的條件下以豆?jié){發(fā)酵液作為培養(yǎng)基代謝t1時(shí)間的藥液。在此基礎(chǔ)上，以治療腎陰虛證效果最好的樣品D1作為代表，論文深入研究了LW-PSB對(duì)腎陰虛小鼠HPA軸的影響，結(jié)果表明，腎陰虛小鼠服用LW-PSB后，能顯著降低血漿促腎上腺激素釋放激素（CRH）、促腎上腺激素（ACTH）、皮質(zhì)酮（CorT）含量，即能對(duì)抗HPA 軸功能亢進(jìn)，使其恢復(fù)正常

6、，說(shuō)明LW-PSB調(diào)節(jié)HPA軸的平衡是其主要的藥理作用之一。 然后采用高效液相色譜技術(shù)，對(duì)LW-PSB使用乙腈-0.15％磷酸進(jìn)行梯度洗脫，使其復(fù)雜的成分得以較好的分離，建立了LW-PSB的HPLC指紋圖譜。 接著將18份樣品的HPLC指紋圖譜與小鼠腎陰虛實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的藥理活性結(jié)果聯(lián)系起來(lái)，以此建立LW-PSB的HPLC藥效指紋圖譜，并采用多元線性回歸的方法，得到與藥效相關(guān)的14個(gè)峰，其中11個(gè)峰成正相關(guān)（包括已知峰沒(méi)食子

7、酸和丹皮酚），以X10對(duì)藥效的影響最大。由回歸的調(diào)整保留系數(shù)還可以看出，除已知成分外，LW-PSB中還有其他成分亦有顯著的增強(qiáng)免疫力的活性，這有待于進(jìn)一步研究。 論文最后對(duì)于藥效相關(guān)成分的來(lái)源進(jìn)行了研究，結(jié)果表明X1、X6來(lái)源于茯苓，X2、X3、X11來(lái)源于山茱萸和牡丹皮，X4來(lái)源于山藥和澤瀉，X7來(lái)源于山茱萸，X9來(lái)源于山茱萸和山藥，X10、X13、X15來(lái)源于牡丹皮，而X8、X12、X14則來(lái)源于多味藥材。 以上的研