棉花懸浮細胞系的建立及其培養(yǎng)細胞的程序性死亡的觀察研究.pdf

1、細胞的死亡一般分為程序性死亡和壞死兩種。細胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)是指生物在發(fā)育和脅迫反應中的一種受基因控制的、主動的、有序的細胞死亡過程。對動物細胞程序性死亡的研究表明，PCD一般具有比較典型的形態(tài)和生化特征，即細胞收縮、核濃縮、染色質邊緣化、核DNA被剪切成寡聚核小體大小的片斷并最終被膜包圍形成凋亡小體。核DNA降解斷裂產生帶有3、--OH端的寡聚核小體片斷，在凝膠電泳上呈以140-180bp倍

2、增的DNA“梯”(DNAladder)。壞死(necrosis)是一種不受細胞控制的損傷性細胞死亡過程，壞死細胞不能呈現出DNAladder。根據DNAladder的有無，可以將PCD與細胞壞死區(qū)分開來。對整株植物進行PCD機理的研究常常要涉及到要將死亡細胞從正常細胞區(qū)分開來，而每個單個細胞細胞都有其內在的死亡表達程序。因此，建立由單細胞或原生質體組成的懸浮系可以大大的降低細胞環(huán)境的復雜性，可作為PCD研究的理想系統(tǒng)，對研究PCD的基因

3、表達調控機理和信號傳導途徑非常有利。近年來，對植物細胞程序性死亡的研究報道不斷增多，其中很多工作都是從懸浮細胞系著手的。 本試驗選用陸地棉(Gossypiumhirsutum.L)品種“珂字201”和“鄂抗9”作為試驗材料，從無菌苗下胚軸切段誘導愈傷組織，建立棉花懸浮細胞系；同時對棉花懸浮細胞系建立過程中激素的配比和濃度、培養(yǎng)基成分、懸浮細胞的生長過程進行了較系統(tǒng)的研究。結果表明：MS+2，4-D0.5mg/L+KT0.1mg/

4、L和MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基有利于細胞分裂，能產生體積較大，均勻一致，細胞活力強的單細胞和小細胞團，適合于進行細胞生長調控及PCD研究。而MS+IBA0.5mg/L+KT0.1mg/L和MS+IBA0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基則有利于形成大的細胞團和不同時期的胚狀體，適合于進行胚狀體的發(fā)生發(fā)育的研究。鉀鹽、肌醇有利于細胞的分裂增殖，且能抑制胚狀體的發(fā)生?？梢酝ㄟ^增加鉀鹽(K+)、肌醇含量來調節(jié)

5、細胞的生長狀態(tài)和細胞活性，以建成分裂增殖快、細胞活性強的懸浮細胞系。在懸浮培養(yǎng)過程中，管狀細胞漸漸消失，被球狀的單細胞和小細胞團所替代。棉花胚性愈傷懸浮細胞的生長曲線呈S形，在起始培養(yǎng)的0～3d，是生長的延遲期；在第3～15d，是指數增長期；到第15d以后，生長速度降低，是靜止期。懸浮培養(yǎng)的棉花細胞必須在15d以前進行繼代，以保持其旺盛的分裂能力和細胞活性。 試驗中以棉花懸浮細胞系為研究對象，探討了在自然衰老和在熱激、喜樹堿、串

6、珠鐮孢菌毒素、放線菌酮等誘導條件下細胞程序性死亡的發(fā)生機制。通過細胞學觀察和抽提基因組DNA進行瓊脂糖膠電泳研究表明，棉花胚性懸浮細胞在MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第17天，細胞生活力開始下降；至第21天可檢測到核小體大小倍增的DNALadder存在。42±3℃熱激、10μmol/L喜樹堿、20μmol/L串珠鐮孢菌毒素和50mmol/L放線菌酮分別處理可誘導MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1

7、mg/L培養(yǎng)基中的棉花懸浮細胞發(fā)生程序性死亡。在MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L和MS+IBA0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的棉花胚性細胞處于不同的生理狀態(tài)，兩種不同狀態(tài)的棉花懸浮細胞對熱激、喜樹堿、串珠鐮孢菌毒素等誘導因子的反應不同。 試驗中還發(fā)現，棉花胚性懸浮細胞在僅含生長素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，生長良好；但當轉入到不含生長素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時，在1-7天內則會大規(guī)模的死亡。對這些細胞進

8、行染色(FDA、DAPI)和細胞學觀察發(fā)現，在轉培養(yǎng)后第3-4天可見明顯的核質濃縮、胞質收縮，而高溫處理引起的細胞壞死無此現象。抽提懸浮細胞基因組DNA進行凝膠電泳又發(fā)現：這種細胞死亡還伴隨有典型的DNALadder出現，而細胞壞死和對照無DNALadder。表明這種由生長素撤除引起的細胞死亡是一種程序性死亡。且這種細胞死亡能被水解酶抑制劑(NEM、TLCK)和Caspase抑制劑(AC-YVAD-CMK)所抑制，從而進一步證明這種細胞

9、死亡是一種PCD，同時也表明水解酶和類Caspase(CLPs)參與到了這類細胞程序性死亡(PCD)過程之中。 研究中還發(fā)現，棉花懸浮細胞經高濃度細胞分裂素(2mg/LKT或4mg/LKT)處理后也大量死亡，培養(yǎng)物呈褐黑色；抽提總DNA，進行瓊脂糖膠電泳，結果表明：2mg/LKT和4mg/LKT兩處理中有明顯的大小為140～180bp及其倍增量片段的DNA“梯”(DNALadder)。進行PI和FDA染色顯微觀察可以看到：2mg

10、/LKT處理中大部分細胞的細胞核較小，核質濃縮，呈棒形或彎月形；胞質濃縮，出現了不對稱的質壁分離，且喪失了FDA染色活性。這些結果表明由高濃度細胞分裂素處理引起的棉花懸浮細胞大規(guī)模死亡也是一種PCD。這與Carimi等(2003)在胡蘿卜和擬南芥懸浮細胞中觀察到的現象一致。不同的生理狀態(tài)(UCSA和BAE)和不同生長時期(指數增長期和靜止期)的棉花懸浮細胞對高濃度細胞分裂素的誘導反應表現出差異。UCSA狀態(tài)的懸浮細胞對高濃度細胞分裂素更

11、敏感，而BAE狀態(tài)的棉花懸浮細胞對高濃度細胞分裂素的敏感性則較弱。指數增長期的UCSA棉花懸浮細胞比靜止期的UCSA棉花懸浮細胞對高濃度的細胞分裂素更敏感。研究還發(fā)現，激素間的相互作用對高濃度細胞分裂素誘導的PCD也會產生影響：2，4-D對由高濃度細胞分裂素誘導的細胞程序性死亡起抑制作用，而ABA則不能。 黃萎病菌分泌的毒素是導致黃萎病的關鍵生化因子。用26μg/mlT9和V天門的粗毒素分別處理鄂抗9和珂字201懸浮細胞發(fā)現，都

12、能誘導細胞死亡，但通過死亡曲線的比較發(fā)現：V天門的粗毒素處理鄂抗9懸浮細胞后的死亡進程與其他處理的不同，其細胞死亡發(fā)生得更早更快。經過抽提基因組DNA進行電泳分析發(fā)現：僅V天門的粗毒素處理鄂抗9的組合中有DNALadder出現。對這一現象的合理解釋就是在V天門中可能存在與鄂抗9的抗性基因(R)相對應的無毒基因(avr)，而在T9中不存在與鄂抗9的抗性基因(R)相對應的無毒基因(avr)。因此，V天門的粗毒素能引起鄂抗9懸浮細胞的HR，T