抗豬囊尾蚴特異性卵黃抗體的制備與鑒定及其診斷豬囊尾蚴病作用研究.pdf

1、目的：豬囊尾蚴病是由豬帶絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)寄生中間宿主而引起的一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病,是我國(guó)重點(diǎn)防治的寄生蟲(chóng)病之一。它不僅嚴(yán)重地危害著廣大人民群眾的健康,也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成極大的損失。加強(qiáng)豬囊尾蚴病的診斷研究對(duì)其防治具有重要意義。本課題利用從豬囊尾蚴cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出來(lái)的cC1基因,克隆至原核表達(dá)載體,利用所得的重組蛋白,免疫25w產(chǎn)蛋海蘭母雞,制備抗豬囊尾蚴特異性雞卵黃免疫球蛋白(IgY)并鑒定。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)IgY效價(jià),大量純化效價(jià)較高階段

2、的IgY,通過(guò)間接ELISA試驗(yàn)和Dot-ELISA試驗(yàn)探討cC1蛋白和IgY用于診斷豬囊尾蚴病的價(jià)值,為豬囊尾蚴病的免疫學(xué)診斷提供一種新的方法。
　　方法：重組質(zhì)粒pET28a-cC1陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21,提質(zhì)粒,雙酶切鑒定(BamHI、XholI)陽(yáng)性克隆,并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Westernblot鑒定,純化cC1蛋白。購(gòu)買(mǎi)未經(jīng)免疫的海蘭母雞雛雞

3、,養(yǎng)至25W產(chǎn)蛋。每只母雞以200mg/只進(jìn)行皮下加肌肉多點(diǎn)注射免疫,共免疫4次,首次免疫后28d進(jìn)行加強(qiáng)免疫3次,每次間隔時(shí)間為10d。收集免疫前、后雞蛋,標(biāo)記后4℃保存?zhèn)溆?。水稀釋法粗提抗豬囊尾蚴IgY抗體,鹽析法純化抗體,SDS-PAGE和Western-blotting進(jìn)行鑒定。間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià),選取效價(jià)最高時(shí)間段的雞蛋,EGGstractTMIgYPurificationSystem純化試劑盒大量提取純化IgY抗體

4、4℃保存?zhèn)溆谩＠胏C1蛋白與111份患者血清(正常人血清30例,豬囊尾蚴感染者血清20例,血吸蟲(chóng)感染者血清30例,鉤蟲(chóng)感染者血清16例,華支睪吸蟲(chóng)感染者血清15例)反應(yīng),進(jìn)行敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性分析,檢測(cè)重組抗原活性;同時(shí)利用制備的抗豬囊尾蚴IgY抗體與111份患者血清(豬囊尾蚴感染者血清20例,正常人血清30例,血吸蟲(chóng)感染者血清30例,鉤蟲(chóng)感染者血清16例,華支睪吸蟲(chóng)感染者血清15例)反應(yīng),進(jìn)行敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性分析,

5、觀察制備的抗豬囊尾蚴IgY抗體用作診斷試劑的潛能。
　　結(jié)果：重組質(zhì)粒pET28a-cC1限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定與目的基因大小(1056bp)相符,同時(shí)測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-cC1構(gòu)建成功。Lowry法測(cè)定制備的純化的重組cC1蛋白濃度為3.5g/l,相對(duì)分子量約40ku。免疫海蘭母雞后,間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià),初次免疫后5d左右產(chǎn)生抗體,隨著時(shí)間推移,抗體滴度逐漸上升,至免疫后55d達(dá)到最高峰,效價(jià)達(dá)到1:

6、105以上。不同產(chǎn)蛋母雞之間抗體滴度存在個(gè)體差異。用EGGstractTMIgYPurificationSystem純化試劑盒大量純化IgY,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)測(cè)定試劑盒測(cè)得的IgY濃度為4.96g/l。SDS-PAGE檢測(cè)IgY分子量與理論值一致。Western-blotting顯示,免疫后的IgY與cC1蛋白可以相互識(shí)別,而免疫前的雞蛋的抗體提取物則不能識(shí)別cC1蛋白。
　　以cC1包板,成功建立間接ELISA體系,檢測(cè)20例豬囊尾

7、蚴病患者血清中抗體,敏感性為85％,特異性為92.20%;假陽(yáng)性率為15%;假陰性率為7.8%;陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為68%;陰性預(yù)測(cè)值為96.5%;Youden指數(shù)為0.772(真實(shí)性較好),總一致率90.1%;期望一致率:Pe為67.57%;Kappa值:K=0.6947(一致性好);陽(yáng)性似然比9.67%;陰性似然比0.16;初步實(shí)驗(yàn)表明用cC1診斷豬囊尾蚴血清中抗體有著較為滿意的結(jié)果。
　　Dot-ELISA檢測(cè)20例豬囊尾蚴病患者血

8、清中循環(huán)抗原,敏感性為95%,特異性為98.9%,假陽(yáng)性率為5%,假陰性率為1.1%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95%,陰性預(yù)測(cè)值為98.9%,Youden指數(shù):YI為0.939(真實(shí)性很好),總一致率P0為98.2%,期望一致率Pe為70.46%,Kappa值為0.939,一致性好;與華支睪吸蟲(chóng)病患者血清、血吸蟲(chóng)病患者血清及鉤蟲(chóng)蟲(chóng)病患者血清無(wú)交叉反應(yīng)。
　　結(jié)論：本研究成功大量制備了抗豬囊尾蚴特異性IgY抗體,具有良好的安全性和穩(wěn)定性,易于保