順反異構(gòu)酶Pin1調(diào)控食管鱗癌發(fā)病的分子機(jī)制.pdf

1、食管癌為最常見的人類惡性腫瘤之一。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:鱗狀上皮細(xì)胞癌(ESCC)是我國食管癌發(fā)病率最高的病理組織學(xué)類型。目前臨床治療食管癌的方法主要是:新輔助化療、結(jié)合術(shù)前小劑量放療以及外科手術(shù)切除。據(jù)統(tǒng)計(jì),食管癌患者術(shù)后5年生存率為25-40％。由于食管癌前期發(fā)病隱匿,容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,通?；颊咔皝砭驮\時,病情多為中、末期。很多患者喪失了手術(shù)的機(jī)會。隨著外科技術(shù)水平的不斷發(fā)展和放療、化療方案的日趨成熟,食管癌的綜合治療達(dá)到了一個新的水

2、平,但其手術(shù)后5年生存率較以往,并沒有顯著的提高。食管癌真正的發(fā)病機(jī)制尚未明確,采取對癥治療原則使得醫(yī)療手段十分被動?，F(xiàn)代循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展證明,只有探明食管癌發(fā)病的機(jī)制,針對相關(guān)信號因子的表達(dá)加以調(diào)控,切斷其發(fā)病機(jī)制中的信號傳導(dǎo)通路,才能夠最終達(dá)到預(yù)防食管癌、提高食管癌早期確診率、延長食管癌患者的生存時間,改善食管癌患者的生存質(zhì)量。
　　 目前的研究報道,肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶Pinl(peptidyl-prolyl eis/tr

3、ansisomerase Pin1)在許多癌癥中高表達(dá),并且還可以作為一些癌癥的預(yù)后指標(biāo),其介導(dǎo)的肽酰-脯氨酰異構(gòu)化參與腫瘤發(fā)生的許多信號通路的調(diào)節(jié),與食管癌關(guān)系密切的c-Jun、P53、NF-κB、CyclinD1、β-catenin等均為Pin1的作用底物。Pin1也參與許多重要的細(xì)胞致癌事件中,比如細(xì)胞分化,血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移等,對Pin1的抑制可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時,一些選擇性抑制Pin1的化合物也已經(jīng)得到了鑒定。這些研究表明

4、,Pin1介導(dǎo)的磷酸化后調(diào)節(jié)可以提供一種新的破壞原癌通路的機(jī)會,同時提供了一條新的抗癌治療途徑。研究報道,Pin1敲除小鼠不僅可以正常發(fā)育,而且對轉(zhuǎn)基因引起的致癌性有很高的抵制能力,提示Pinl抑制劑可能具有小的非特異性毒性。
　　 本課題系統(tǒng)研究了Pin1在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)；通過小干擾RNA技術(shù)以及天然藥物Juglone的應(yīng)用,抑制了Pin1的表達(dá)并測定了其細(xì)胞生物學(xué)特性的變化；通過哺乳動物雙雜交實(shí)驗(yàn),篩選

5、了與Pin1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)驗(yàn)中得到了一個新的轉(zhuǎn)錄因子ATF1。并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步的研究。本論文的研究為確定Pin1在食管鱗癌發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。在食管癌經(jīng)典化療藥物CDDP使用的基礎(chǔ)上聯(lián)合特異性信號通路阻斷的治療新策略奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 第一章Pin1在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　 方法：
　　 1.收集食管癌根治術(shù)中切除的食管癌組織和癌旁組織,通過病理學(xué)診斷和分型,針

6、對食管鱗癌組織和癌旁組織進(jìn)行研究。
　　 2.通過免疫組織化學(xué)檢測食管鱗癌癌周組織與食管鱗癌組織中Pin1的表達(dá),將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 3.通過細(xì)胞化學(xué)以及蛋白印跡技術(shù)檢測經(jīng)典食管鱗癌細(xì)胞株中Pinl的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)角度明確了Pin1在食管鱗癌組織、經(jīng)典食管癌細(xì)胞株中過表達(dá),為進(jìn)一步研究Pin1在食管鱗癌中的作用奠定了研究基礎(chǔ)。
　　 第二章穩(wěn)定干擾Pin

7、l的食管鱗癌細(xì)胞系的建立及其對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　 方法：
　　 1.通過小干擾RNA技術(shù)以及藥物選擇壓力的應(yīng)用,篩選穩(wěn)定表達(dá)針對Pin1小干擾RNA的食管鱗癌細(xì)胞系。
　　 2.通過流式細(xì)胞術(shù)以及MTT實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定基因沉默Pin1后食管鱗癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的變化。
　　 3.通過流式細(xì)胞術(shù)以及MTT實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定基因沉默Pin1后,食管鱗癌細(xì)胞系對經(jīng)典化療藥物順鉑的敏感性。
　　 結(jié)

8、果：
　　 1.篩選到了穩(wěn)定基因沉默Pin1的食管鱗癌細(xì)胞系。
　　 2.基因沉默Pin1后食管鱗癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制,食管鱗癌細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著提高。
　　 3.干擾食管鱗癌EC1細(xì)胞Pin1的表達(dá)后,可以增加對其對臨床常用化療藥物順鉑的敏感性。基因沉默Pin1可以提高順鉑抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,二者抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)疊加,理論上可以提高順鉑抗腫瘤的療效。

9、>　　 第三章Pin1抑制劑Juglone對食管鱗癌細(xì)胞EC1生物學(xué)特征的影響
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞系EC1,使用植物提取的天然Pin1抑制劑Juglone對細(xì)胞進(jìn)行處理。MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞生長增殖狀況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 MTT試驗(yàn)表明,Juglone對EE1細(xì)胞生長有明顯的抑制作用,且抑制作用隨著作用濃度和作用時間的提高呈明顯上升。流式細(xì)胞

10、儀檢測結(jié)果表明,加入Juglone培養(yǎng)48 h后,EC1細(xì)胞出現(xiàn)G2＼M期阻滯。Juglone培養(yǎng)48 h后,EE1細(xì)胞的凋亡率隨著作用濃度的升高而顯著提升。
　　 第四章食管鱗癌中與Pin1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子ATF1及其功能研究
　　 方法：
　　 1.哺乳動物雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選與Pin1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 2.GST pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Pin1與目的因子的相互作用。
　　 3

11、.流式細(xì)胞儀檢測該目的因子對于細(xì)胞增殖的作用。
　　 結(jié)果：
　　 篩選到了一個新的,與Pin1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子ATF1。對其在細(xì)胞增殖方面的作用進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)ATF1過表達(dá)可以造成食管鱗癌細(xì)胞S期阻滯。
　　 1.Pin1在食管鱗癌組織、食管鱗癌細(xì)胞株EC1、EC9706中過表達(dá)。
　　 2.篩選并建立穩(wěn)定基因沉默Pin1的食管鱗癌細(xì)胞系,為后期研究Pin1的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 3.使用小干

12、擾RNA技術(shù)和＼或植物提取物Juglone抑制Pin1基因表達(dá),可明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖；提高食管鱗癌細(xì)胞凋亡率；下調(diào)食管鱗癌EC1細(xì)胞中Pin1的表達(dá)后,可以提高食管鱗癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性?；虺聊琍inl可以提高順鉑抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上可以推測:通過分子生物學(xué)手段下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中Pin1的表達(dá)水平同時使用Pin1的天然植物體抑制劑Juglone,二者抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)食管癌