Bex2對人腦膠質瘤干細胞分化增殖影響的體外實驗研究.pdf

1、目的：構建Bex2(brain expressed X-linked，Bex2)真核表達載體轉染人腦膠質瘤干細胞，以觀察Bex2對腦膠質瘤干細胞分化增殖的影響，為膠質瘤的基因治療提供理論基礎。 方法： 1.以Trizol一步法提取人腦膠質細胞的總RNA為模板，采用RT-PCR法獲得Bex2的cDNA；用T載體連接后；連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌JM101進行篩選、序列測定正確，雙酶切后將Bex2與質粒pcDNA3.1(+)連接成

2、功。 2.取人腦膠質瘤手術標本制備單細胞懸液后，加入生長因子EGF、bFGF和B27類似神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基中克隆培養(yǎng)。待細胞懸浮形成腦腫瘤干細胞球時備用。 3.真核載體聯(lián)合脂質體轉染體外培養(yǎng)的腫瘤干細胞，分別于轉染后18 h、36 h、48 h、72 h、96 h觀察基因Bex2在腦膠質瘤干細胞的表達。 4.隨機化分三組：實驗組，空載體組，空白對照組。5.各組均在干擾18 h、36 h、48 h、72 h、96

3、 h后收集細胞，MTT法檢測膠質瘤干細胞生長抑制率，用Hoechst染色試劑盒檢測膠質瘤干細胞的凋亡情況，用Western-blot檢測Bex2基因的表達。 結果： 1.成功構建后天性沉默基因Bex2的真核表達載體； 2.基因Bex2在轉染膠質瘤干細胞后18h即有表達，48h達到高峰，以后逐漸下降； 3.MTT法檢測結果顯示，在轉染腫瘤干細胞36h、48 h、72h、96h時實驗組細胞生長抑制率明顯高于空

4、載體組和空白對照組(P<0.05)；轉染72 h時實驗組細胞生長抑制率高于同組的18 h、36 h、48 h和96 h(P<0.05)； 4.在應用Hoechst染色檢測細胞凋亡顯示，在轉染36h、48 h、72h、96h時實驗組細胞凋亡率明顯高于空載體組和空白對照組(P<0.05)；72h時實驗組細胞凋亡率高于同組18h、36h、48h和96h(P<0.05)。 結論：Bex2能夠抑制腦膠質瘤干細胞增殖和生長，促進膠質