番茄Aux-IAA基因的克隆與功能分析.pdf

1、生長素是一類重要的植物激素，它與植物生長發(fā)育的許多過程相關(guān)。在細胞水平上，生長素影響細胞的伸長、分裂和分化。在個體水平上，生長素在植物的頂端優(yōu)勢、側(cè)根／不定根的形成、植物的向性反應、果實的座果和發(fā)育、維管組織的分化和胚的形成等方面是都是必需的。由于生長素具有這些多樣化的調(diào)節(jié)活性，因此，生長素、生長素反應以及生長素信號轉(zhuǎn)導引起了人們極大的興趣。已有的研究成果表明，盡管生長素可以通過直接影響細胞膜和細胞骨架的功能來調(diào)節(jié)一些細胞反應，但生長素

2、更多是通過調(diào)控基因表達來影響植物的發(fā)育和其他的一些反應。Aux／IAA、SAUR和GH3等是三類主要的生長素早期誘導表達的基因，生長素能夠誘導這三類基因中的多數(shù)基因快速、特異、并且在不需要新的蛋白質(zhì)生物合成的條件下表達，這些基因也被認為是生長素誘導的原初表達基因。在這三類基因中，Aux／IAA基因家族的研究相對較多。 以擬南芥為模式植物的植物生物化學、分子生物學和遺傳學的研究也已經(jīng)證實Aux／IAA蛋白在生長素的信號轉(zhuǎn)導和植物

3、的生長發(fā)育中起著重要的作用。擬南芥Aux／IAA基因突變體表現(xiàn)出與生長素直接相關(guān)的發(fā)育表型的改變，包括改變植株的向光性、向地性、頂端優(yōu)勢、根的形成、莖／下胚軸的伸長、葉片的展開以及黑暗條件下葉片的形成等。在氨基酸序列上，番茄Aux／IAA蛋白與擬南芥Aux／IAA蛋白有比較大的差異，且番茄果實為鮮果，生理學的研究表明生長素與番茄果實的座果、膨大和成熟等有著密切的關(guān)系，外源生長素能促進番茄果實的單性結(jié)實，因此以番茄為模式植物研究生長素信號

4、轉(zhuǎn)導相關(guān)的Aux／IAA基因的生物學功能，對全面了解生長素在植物根、莖、葉、花、果等的生長、發(fā)育以及形態(tài)建成過程中所發(fā)揮的作用，揭示番茄單性結(jié)實可能的分子機理，闡明生長素信號轉(zhuǎn)導的復雜分子機制具有重要的理論意義。對番茄生產(chǎn)中合理利用生長素、生長素類似物以及生長素轉(zhuǎn)運抑制物等調(diào)控番茄植株的生長發(fā)育、果實的座果、果實的發(fā)育成熟等也具有實際的指導意義。 本研究的目的：比較全面的分析番茄Aux／IAA基因的進化和組織／器官表達情況，初步

5、預測這些基因可能的功能；利用轉(zhuǎn)基因手段分析三個Aux／IAA基因，即SlIAA3，SllAA4和SlIAAl4，在番茄生長和發(fā)育過程中的生物學功能，從分子水平初步闡明它們可能的作用機制；初步分析這三個基因在生長素效應中發(fā)揮的作用，創(chuàng)建一些應用于生長素信號轉(zhuǎn)導研究的材料；創(chuàng)造一些單性結(jié)實的材料，應用于果實單性結(jié)實分子機理的研究。 1.利用生物信息學手段從核酸數(shù)據(jù)庫中獲得22個潛在的番茄Aux／IAA基因，利用生物信息學手段對這些基

6、因的結(jié)構(gòu)及其進化關(guān)系進行了分析。 2.RT-PCR分析了番茄11個Aux／IAA基因在不同組織／器官、果實不同發(fā)育時期以及不同條件下的基因表達特性，結(jié)果表明SIlAA4在所有的分析材料中表達量均很高，而其他的基因在不同組織／器官、果實不同發(fā)育時期以及不同條件下的基因表達顯示出不同的表達特異性。 3.利用RACE技術(shù)克隆了番茄7個Aux／IAA基因的全長cDNA和一個Aux／IAA基因的5’端。獲得了SIlAA3基因的基因

7、組DNA序列，DNA序列分析結(jié)果表明SIlAA3基因由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成。 4.利用RFLP分析了SlIAA3、SllAA4、SlIAA14三個基因在M82和LA716兩個番茄種中的基因多態(tài)性，結(jié)果表明這三個基因在這兩個種中有明顯的多態(tài)性，且結(jié)果還顯示SlIAA3、SIlAA4基因為單拷貝基因、易于同番茄其他的Aux／IAA基因區(qū)分，并且這兩基因在兩個種中比較保守。 5.利用76個IL群體將SllAA3和SllA

8、A4基因分別定位在番茄第9染色體的9-G區(qū)域和第4染色體的4-G區(qū)域，分別與番茄hi(hilara突變)基因和e(entire突變)基因在同一區(qū)域。 6.構(gòu)建了SlIAA3、SllAA4、SllAA4三個基因的超量表達、反義抑制和RNAi植物遺傳轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得番茄轉(zhuǎn)基因植株。 7.轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，SlIAA3基因與番茄幼苗根系的發(fā)育相關(guān)，RNAi轉(zhuǎn)基因植株后代幼苗初生根的伸長受到抑制。幼苗

9、水培結(jié)果也顯示，反義抑制和IWAi轉(zhuǎn)基因植株后代幼苗均有短而弱的根系。 8.轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，SIlAA4明顯影響番茄葉片的形態(tài)建成。超量表達、反義抑制和RNAi的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出葉片的復雜性降低，其中以正義和RNAi的效果明顯，部分轉(zhuǎn)基因植株甚至全株葉片均為單葉，葉片的形態(tài)特征與entire突變體及其相似。 9．轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，SIlAA14也參與番茄幼苗根的形態(tài)建成，RNAi轉(zhuǎn)基因植株后代幼苗初生根的伸長被抑