納米載銅硅酸鹽對水產(chǎn)病原菌的吸附、殺菌活性及其在羅非魚上的應用效果與機理研究.pdf

1、長期使用抗生素和抗菌藥物，造成諸如細菌抗藥性、耐藥基因轉(zhuǎn)移、水產(chǎn)品中藥物殘留等不良后果，直接或間接威脅人類健康，而且由于長期濫用抗生素引起水環(huán)境污染，導致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，生態(tài)平衡失調(diào)。因此，開創(chuàng)新的科研途徑，研發(fā)安全無公害的新型抗菌材料已迫在眉睫。 采用納米無機材料為載體，擔持抗菌金屬離子而制成的金屬系納米無機抗菌材料，具有穩(wěn)定性好、不易使細菌產(chǎn)生耐藥性、作用持久，使用安全等優(yōu)點。層狀硅酸鹽材料MMT的結(jié)構(gòu)、化學鍵、類質(zhì)同像代替、

2、層間域與層電荷、陽離子交換等本質(zhì)屬性決定了MMT的納米屬性。MMT納米屬性是納米化處理與加工的基礎(chǔ)。本課題以MMT為材料構(gòu)建納米硅酸鹽(Layer silicate Nanoparticle，LSN)；從水產(chǎn)病原菌電性、疏水性和細胞膜的特異性著手，對納米硅酸鹽進行改性以提高其對水產(chǎn)病原菌的吸附選擇性；在此基礎(chǔ)上，在硅酸鹽納米材料上負載具有抑菌作用的銅，構(gòu)建了納米載銅硅酸鹽(Cu-loaded silicate Nanocomposite

3、,CSN)，并在以下幾個方面開展研究：(1)以LSN為對照，研究CSN的結(jié)構(gòu)；CSN的吸附、殺菌活性和機理：CSN對嗜水氣單胞菌粘附羅非魚上皮細胞的阻斷作用及其對嗜水氣單胞菌粘附引起魚上皮細胞膜損傷的影響；(2)以LSN、硫酸銅和黃霉素為對照，研究CSN對羅非魚的應用效果和機理；(3)通過羅非魚養(yǎng)殖15天不換水試驗，研究CSN對養(yǎng)殖水體水質(zhì)和菌群的影響。 主要研究結(jié)果如下： 1.CSN的平均粒徑為41nm。CSN所載銅主

4、要是以水合或復合陽離子的形式，以 離子交換的方式進入硅酸鹽晶格層間，還有少量銅以化學吸附的形式進入Si-O 四面體和Al-O八面體的微孔中，所載銅可降低硅酸鹽所帶負電荷的密度，這 有助于CSN與細菌間的靜電吸附作用。與LSN相比，CSN的外比表面積、孔 體積和孔徑增大，而總比表面積、微孔比表面積、微孔體積則減小。 2.CSN的Zeta電位隨pH升高(pH值2～10)而增大，當pH=4.8時，Zeta電位從 負值轉(zhuǎn)變?yōu)檎?/p>

5、值；LSN、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的Zeta電 位隨pH升高而降低。當pH=6時，材料和細菌的Zeta電位均隨離子強度的 增大而增大。 3．體外吸附試驗表明：在pH為6.0、離子強度為0.01 mol／LNaNO<,3>的條件下， CSN在120 min左右達到吸附平衡，對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單 胞菌的平衡吸附率分別為96.6％，94.4％，99.4％；而LSN在60 min左右達到 吸附平

6、衡，對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的平衡吸附率分別為 42.1％，37.4％，46.5％。pH和離子濃度對細菌吸附率影響的結(jié)果表明：CSN對 細菌的吸附率先隨pH的增加而減小，然后到pH=4.8時又逐漸增大，LSN對 細菌的吸附力隨著pH的增加而逐漸減?。籐SN和CSN對細菌的吸附率均隨 著離子強度的增加而降低。 4．體外抗菌試驗表明：CSN對嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌的最小 殺菌濃度分別為600

7、、600、300 mg／L，而LSN未顯抗菌活性。CSN對細菌胞 內(nèi)酶活性影響結(jié)果顯示，CSN可使細菌細胞膜發(fā)生損傷或通透性增大，導致細 菌胞內(nèi)酶的外漏。CSN對細菌呼吸代謝影響的結(jié)果表明，CSN可抑制三羧酸循 環(huán)途徑。原子力顯微鏡動態(tài)觀察CSN作用下嗜水氣單胞茵形態(tài)變化的結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，CSN能破壞細菌細胞膜而產(chǎn)生殺滅效果。 5．CSN對嗜水氣單胞菌粘附羅非魚上皮細胞影響的結(jié)果顯示：CSN顯著降低了嗜 水氣單胞菌對鰓、皮

8、膚和腸上皮細胞的粘附率；嗜水氣單胞茵粘附魚上皮細胞 后胞漿游離鈣、細胞膜磷脂酶A<,2>活性，細胞外LDH含量和細胞損傷率(膜通透 性)、腸上皮細胞膜熒光偏振度和膜脂微粘度(膜流動性)顯著增加；CSN可顯著 降低由于嗜水氣單胞菌粘附魚上皮細胞引起的細胞膜損傷。 6．選取平均體重為3.9 g的健康尼羅羅非魚，飼喂含0.15％CSN的日糧56天，發(fā) 現(xiàn)CSN顯著提高了羅非魚的生長性能和存活率。進一步研究得知，CSN顯著 降

9、低腸道細菌數(shù)量，并明顯改變腸道菌群的組成，使氣單胞菌屬，假單胞菌屬， 黃桿菌屬，不動桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬，腸桿菌科，弧菌屬的百分比減少；顯著提 高白細胞吞噬活性、血清和體表粘液溶菌酶活性、紅細胞C<,3b>受體花環(huán)百分率； 顯著提高各腸段絨毛和微絨毛高度；顯著提高腸組織蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶 活性和飼料養(yǎng)分的表觀消化率。與黃霉素組相比，CSN組羅非魚日增重、特定 生長率、腸組織淀粉酶和脂肪酶、中腸微絨毛高度顯著提高，在其他指標上均

10、 具一定的優(yōu)勢，但差異不顯著。結(jié)果提示：CSN通過抑制腸道病原菌的增殖， 提高機體的非特異性免疫機能，改善腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，以益于消化酶的分泌和飼料養(yǎng)分的消化，從而提高羅非魚的生長性能和存活率。7．選取平均體重為43.5g的健康尼羅羅非魚，飼喂含0.15％CSN的日糧15天， 試驗期間不換水，發(fā)現(xiàn)CSN顯著提高了羅非魚的生長性能和存活率；降低水 體氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和COD<,Mn>；使水體細菌數(shù)量顯著降低，并使水 體菌

11、群組成發(fā)生了變化，使氣單胞菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬， 腸桿菌科的百分比減少。結(jié)果提示：CSN通過提高飼料利用效率，降低排入水 域環(huán)境的飼料比例，從而改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)；飼料在水體中溶出的CSN或者通過糞便從羅非魚體內(nèi)排出的CSN仍然具有較高的殺菌活性。 綜上所述，CSN的抗菌機理是基于納米硅酸鹽的吸附性能和Cu<'2+>的殺菌活性，更重要的是，CSN能破壞細菌細胞膜而產(chǎn)生殺滅效果；CSN能有效抑制腸道病原菌的增殖，阻斷病