氟尿嘧啶類藥物抑制胸苷磷酸化酶(TP)表達的胃癌細胞增殖機制的研究.pdf

1、目的
　　 胃癌是世界范圍內最常發(fā)生的惡性腫瘤之一,在我國是腫瘤死亡的主要原因。大多數患者在診斷時已是進展期或發(fā)生遠處轉移,化療是治療晚期胃癌的主要手段。
　　 氟尿嘧啶是胃癌化療的基本用藥,其藥理作用為通過DNA和RNA兩種途徑,干擾胸腺嘧啶的合成。其中,DNA途徑是氟尿嘧啶在胸苷磷酸化酶的催化下直接合成活性代謝產物胸腺嘧啶脫氧核苷(FdUMP),進而影響細胞DNA的合成。
　　 卡培他濱、去氧氟尿苷等氟尿嘧啶

2、前體藥物在體內也需經胸苷磷酸化酶催化轉變?yōu)榉蜞奏?進而發(fā)揮生物學效應。
　　 本實驗以胃癌細胞株SGC7901、MGC803為模型,對氟尿嘧啶類藥物的抗瘤活性及與胸苷磷酸化酶表達水平的關系進行了研究。
　　 方法
　　 1、MTT法檢測去氧氟尿苷對兩種胃癌細胞的增殖抑制
　　 取對數期生長的人胃癌MGC803細胞,SGC7901細胞,進行胰蛋白酶消化,消化后用培養(yǎng)液制成單細胞懸液,調整細胞濃度至5×10

3、4個/ml接種于96孔板,培養(yǎng)12小時后分別加入既定濃度的去氧氟尿苷,每孔最終體積200μl,加藥分別培養(yǎng)24小時,48小時,72小時后,加入MTT,于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入DMSO,在恒溫振蕩器上振蕩10min,室溫20min孵育。放入酶標儀中以570nm波長檢測光密度值(optical density,OD)。空白調零組A490的OD值均數設為零,以平行孔的平均OD值作為各組的OD值。
　　 2、Western B

4、lot檢測兩種胃癌細胞胸苷磷酸化酶表達水平
　　 收集人胃癌MGC803細胞和SGC7901細胞進行Western Blot檢測,加入抗PD-ECGF抗體孵育1h,TTBS洗膜,二抗孵育,洗膜,加入ECL發(fā)光液,孵育5min,曝光,顯影,定影。
　　 3、MTT法分別檢測去氧氟尿苷和氟尿嘧啶對SGC7901細胞的增殖抑制
　　 取對數期生長的SGC7901細胞,進行胰蛋白酶消化,消化后用培養(yǎng)液制成單細胞懸液,調整

5、細胞濃度至5×104個/ml接種于96孔板,培養(yǎng)12小時后分別加入既定濃度的去氧氟尿苷和氟尿嘧啶,每孔最終體積200gl,加藥分別培養(yǎng)48小時,72小時后,加入MTT,于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入DMSO,在恒溫振蕩器上振蕩10min,室溫20min孵育。放入酶標儀中以570nm波長檢測光密度值(optical density,OD)?？瞻渍{零組A490的OD值均數設為零,以平行孔的平均OD值作為各組的OD值。
　　 4、

6、細胞凋亡檢測
　　 取對數期生長的SGC7901細胞,進行胰蛋白酶消化,消化后用培養(yǎng)液制成單細胞懸液,調整細胞濃度至3×105個/ml接種于6孔板,培養(yǎng)12小時后分別加入既定濃度的去氧氟尿苷和氟尿嘧啶。24小時,48小時候分別收集對照組及處理組細胞,冷PBS洗2次,加入5ulAnnexinV和10ulPI避光孵育15min,用FACScan流式細胞儀進行檢測,判定凋亡百分率。CELLQuest軟件進行分析。
　　 5、W

7、estern Blot檢測藥物作用后細胞胸苷磷酸化酶的表達
　　 分別收集對照組及處理組細胞進行裂解,提取細胞蛋白,取20μg處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉移至PVDF膜,5%脫脂奶封閉1h,一抗孵育1h,TBST洗膜,然后二抗孵育30min,TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液,孵育5min,暗室中用X片曝光,顯影,定影。
　　 結果
　　 1、高表達胸苷磷酸化酶的細胞系篩選
　　 通過進行M

8、TT檢測,發(fā)現去氧氟尿苷作用于SGC7901細胞與MGC803細胞后,SGC7901細胞的增殖抑制明顯強于MGC803細胞。通過Western Blot檢測,在SGC7901細胞中,胸苷磷酸化酶表達水平明顯較MGC803細胞高
　　 2、氟尿嘧啶與去氧氟尿苷對SGC7901細胞的增殖抑制
　　 通過進行MTT檢測,發(fā)現無論是氟尿嘧啶還是去氧氟尿苷,對SGC7901細胞的增殖抑制都隨著時間的延長、濃度的加大而逐漸增強。

9、r>　　 3、氟尿嘧啶與去氧氟尿苷對SGC7901細胞的凋亡誘導
　　 流式細胞儀分析顯示,氟尿嘧啶和去氧氟尿苷能誘導SGC7901細胞凋亡,且呈時間劑量依賴性。
　　 4、氟尿嘧啶與去氧氟尿苷對SGC7901細胞胸苷磷酸化酶表達水平的影響
　　 通過Western Blot檢測,在藥物處理過的SGC7901細胞中,胸苷磷酸化酶的含量較對照組細胞明顯上調,而且呈時間劑量依賴性。
　　 結論