糖尿病腎病腎小管上皮細胞表型轉化及羅格列酮對其干預作用的實驗研究.pdf

1、目的：本課題擬通過高糖刺激人類近端腎小管上皮細胞(HK-2)生長和實驗性糖尿病腎病大鼠模型，用羅格列酮分別進行干預實驗，觀察腎小管上皮細胞形態(tài)、增殖狀況及腎小管上皮細胞表型轉化(EMT)相關標志蛋白表達情況。通過體內、外兩部分實驗進一步揭示高糖這一病理因素在腎小管上皮細胞表型轉化過程中的作用和PPAR-γ激動劑治療糖尿病腎病的分子機制，為探討糖尿病腎病的發(fā)病機制及糖尿病腎病的早期治療提供新的線索及理論依據。 方法：第一部分細胞實

2、驗：采用HK-2細胞第3代細胞株，同步培養(yǎng)后分為5組：N組為正常對照組(含5.5mmol/L葡萄糖)，H組為高糖組(含25mmol/L葡萄糖)，M組為高滲對照組(含5.5mmol/L葡萄糖及19.5mmol/L甘露醇)，HR5組為高糖DMEM加低濃度羅格列酮組(H組加入5μmol/L RGZ)，HRlO組為高糖DMEM加高濃度羅格列酮組(H組加入10μmol/L RGZ)。采用MTT法測定HK-2細胞增殖；光鏡和電鏡分別觀察HK-2細胞

3、的基本結構與超微結構；RT-PCR法和Western blot法分別檢測HK-2細胞FSP1、α-SMA、E-cad的mRNA和蛋白表達；收集細胞上清液體用ELISA法檢測TGF-β1的濃度。 第二部分動物實驗：選擇清潔級Wistar雄性大鼠18只，隨機分為3組：N組為正常大鼠對照組(n=6)，D組為糖尿病腎病大鼠模型組(n=6)，R組為糖尿病腎病大鼠羅格列酮(文迪雅)干預組(n=6)。采用雙縮脲法測定24小時尿蛋白定量；硝基酚

4、比色法測定尿NAG酶活性；全自動生化分析儀檢測Scr及24小時Ucr。取腎組織切片后行HE和MASSON染色；免疫組化法檢測FSP1、α-SMA、Col Ⅰ、CK-18表達；RT-PCR法檢測FSP1、α-SMA、CK-18的mRNA表達。 結果：第一部分細胞實驗：①與N組比較，H組：HK-2細胞呈梭形變，電鏡下粗面內質網明顯增加，線粒體及微絨毛明顯減少，細胞內出現(xiàn)肌微絲樣結構；FSP1、a-SMA mRNA和蛋白表達增強(P

5、<0.01)，E-cadmRNA和蛋白表達減弱(P<0.01)；細胞上清液TGFβ1濃度升高(P<0.01)。②與H組比較，RGZ干預組HK-2細胞恢復為多邊形或圓形，電鏡下微絨毛增多，線粒體數目增加，粗面內質網減少：FSP1、a-SMA mRNA和蛋白表達下降(P<0.05或0.01)，E-cadmRNA和蛋白表達增加(P<0.01)；細胞上清液TGFβ1濃度下降(P<0.05或0.01)。高濃度RGZ組較低濃度組FSP1、a-SMA

6、、E-cad的mRNA和蛋白表達變化更顯著(P<0.01)，TGFβ1濃度下降更明顯(P<0.01)。③與N組比較，H組HK-2細胞增殖更為明顯，24hr、48hr、72hr三個時間點，細胞增殖數量分別是N組的1.19倍、1.31倍、1.51倍(P<0.05或0.01)。與H組比較，RGZ干預后HK-2細胞增殖受到抑制(P<0.05或0.01)，48hr、72hr時間點高濃度RGZ組抑制細胞增殖能力較低濃度組更顯著(P<0.05)。

7、 第二部分動物實驗：①與N組比較，D組大鼠尿pro增多、尿NAG酶升高、Scr增高、Ccr下降(P<0.01)；腎組織腎小管變性、間質纖維化病變明顯；FSP1，a-SMA蛋白和mRNA表達水平上調(P<0.01)，CK-18蛋白和mRNA表達水平下調(P<0.01)，Col Ⅰ蛋白表達增加(P<0.01)。②與D組比較，R組尿pro減少、尿NAG酶下降、Scr降低、Ccr升高(P<0.01)；腎組織腎小管變性、間質纖維化病變減輕；F

8、SP1，a-SMA蛋白和mRNA表達下調(P<0.05或0.01)，CK-18蛋白和mRNA表達上調(P<0.05)，Col Ⅰ蛋白表達降低(P<0.05)。 結論： ①高糖刺激后的HK-2細胞和糖尿病腎病大鼠均出現(xiàn)腎小管細胞向肌成纖維細胞的表型轉化，提示糖尿病腎病時存在EMT現(xiàn)象。 ②糖尿病腎病大鼠血尿生化指標和Col Ⅰ表達的變化，提示腎小管上皮細胞表型轉化在促進腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展方面起了重要作用。