牛糞堆肥中厭氧氨氧化菌的群落結構和多樣性研究.pdf

1、堆肥技術作為處理廢棄物有效方法，解決了畜禽糞便直接排放到環(huán)境中，對環(huán)境造成污染及占用空間等問題，同時達到資源合理利用的目的。氮的含量作為堆肥的重要指標，影響著堆肥質量，所以氮素轉化是堆肥中非常重要的部分。厭氧氨氧化作用是在厭氧條件下使NH4+-N和NO2--N轉變?yōu)镹2的過程，屬于氮素轉化的一部分。厭氧氨氧化菌普遍存在多種環(huán)境中，理論上堆肥系統中也應該存在厭氧氨氧化菌，但是關于堆肥中厭氧氨氧化菌的報道卻很少。本研究使用自制發(fā)酵罐進行堆肥

2、，以模擬快速堆肥過程，來研究參與牛糞和稻稈混合堆肥中的厭氧氨氧化菌。通過堆肥樣品理化指標的測定，應用克隆文庫、聚合酶鏈式反應-梯度變性凝膠電泳(PCR-DGGE)、定量PCR的方法檢測堆肥中的厭氧氨氧化菌，探討厭氧氨氧化菌在牛糞堆肥過程中的群落結構、多樣性及豐度的變化情況。本課題的研究將會進一步豐富堆肥氮素循環(huán)理論，同時為厭氧氨氧化菌的廣泛分布提供理論依據。主要研究結果如下:
　　(1)堆肥過程共進行30 d，在第3d進入高溫期(

3、＞45℃)，堆體于堆肥發(fā)酵的第5d達到最高溫58℃，堆體高溫期持續(xù)8 d(3 d～10 d)。在整個堆肥過程中，pH值維持在8.0～9.0之間;含水率呈下降趨勢，堆肥第29 d降至59.7％; C/N呈現下降趨勢，在堆肥第29 d降到18.3; NH4+-N和NO3--N的含量變化呈相反的趨勢，NH4+-N在堆肥高溫期達到最大值(1640 mg/kg)，之后隨著堆肥的進行含量逐漸降低;NO3--N的含量在堆肥初期增長緩慢，在高溫期后迅速

4、增長，腐熟期達到最大值(1430 mg/kg)。隨著堆肥天數的增加，種子發(fā)芽率指數逐漸上升，在第29 d，發(fā)芽率已經達85％以上，說明堆肥已完全腐熟。
　　(2)應用克隆文庫的方法檢測堆肥中厭氧氨氧化菌，16S rRNA基因的克隆文庫和hzo基因克隆文庫的高百分覆蓋率和趨于飽和的稀釋曲線說明本研究所構建的克隆文庫能代表該環(huán)境下大部分厭氧氨氧化菌的基因信息?？寺∥膸旆治鲲@示，在堆肥樣品Day7（高溫期）和Day13（降溫期）中厭氧氨

5、氧化菌多樣性相對較高，系統進化樹分析顯示堆肥中檢測到的序列相似于Candidatus Scalindua、Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia屬的厭氧氨氧化菌。聚類分析顯示，溫度或堆肥時間相近的樣品群落結構更相似，且堆肥過程中厭氧氨氧化菌的群落隨著堆肥進程發(fā)生了變化。
　　(3)應用PCR-DGGE技術分析堆肥過程中厭氧氨氧化菌16S rRNA基因的群落變化。結果表明，各堆肥樣品中均有優(yōu)勢

6、條帶產生。對引物Pla46f/Amx368r的DGGE圖譜進行UPGMA聚類分析表明，各樣品中之間的群落相似性在0.54～0.86之間;對引物Amx368f/Amx820r的DGGE圖譜進行UPGMA聚類分析表明，各樣品之間的群落相似性在0.35～0.84之間。對DGGE條帶進行主成分分析，顯示堆肥中厭氧氨氧化菌群落結構處于不斷變化中，其中降溫期樣品Day13與其它樣品的群落結構差異較大。對優(yōu)勢條帶回收測序后構建系統發(fā)育進化樹，結果與克

7、隆文庫結果相似，主要相似于Candidatus Brocadia、Candidatus Scalindua、CandidatusKuenenia三個菌屬的厭氧氨氧化菌，在堆肥高溫期主要優(yōu)勢菌相似于厭氧氨氧化菌屬Candidatus Brocadia，綜合比較兩對引物檢測后樣品多樣性結果，多樣性較高的樣品是Day7（高溫期）和Day13（降溫期）。
　　(4)厭氧氨氧化菌16S rRNA基因的定量PCR結果，標準樣品的質粒為3.68