12320.水葫蘆谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表達(dá)

1、分類號(hào)：UDC：密級(jí)：學(xué)校代號(hào)：11845學(xué)號(hào)：2111106025廣東工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文(工學(xué)碩士)水葫蘆谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表達(dá)蔣麗花指導(dǎo)教師姓名、職稱：使明齷塾握企業(yè)導(dǎo)師姓名、職稱：玉專業(yè)或領(lǐng)域名稱：生物絲工學(xué)生所屬學(xué)院：鰲王絲王堂瞳論文答辯日期：壘Q!壘生墨旦Q墨目摘要摘要谷氨酰胺合成酶(GS)在高等植物氮代謝中起著重要的作用，是參與氨同化過(guò)程的關(guān)鍵酶。植物GS具有多種同工酶，根據(jù)亞細(xì)胞定位，分為胞液型谷氨酰胺合成酶(G

2、Sl)和質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶(GS2)。水葫蘆在富營(yíng)養(yǎng)化水體中泛濫生長(zhǎng)，會(huì)破壞水體生態(tài)平衡。但水葫蘆具有過(guò)度吸收氮磷營(yíng)養(yǎng)元素的特點(diǎn)，適量的水葫蘆可用來(lái)凈化水質(zhì)。本文基于大豆、小麥等植物GSl基因保守序列，以水葫蘆根部RNA為模板經(jīng)過(guò)兩步法RTPCR法擴(kuò)增出水葫蘆GSl的保守序列片段，再經(jīng)RACE(RapidamplificationofcDNAends)法，克隆了3個(gè)完整的GS1基[](Eichhorniacrassipesglutam

3、inesynthetase，分別標(biāo)號(hào)為EcGSla，EcGSlb，EcGSlc)，3個(gè)基因全長(zhǎng)分別為1434bp、1455bp、1508bp。EcGSla編碼一個(gè)356個(gè)氨基酸殘基的多肽，推測(cè)的多肽分子量大小為393kDa，PI=552。EcGSlb編碼一個(gè)354個(gè)氨基酸殘基的多肽，推測(cè)的多肽分子量大小為390kDa，PI=595。EcGSlc編碼一個(gè)356個(gè)氨基酸殘基的多肽，推測(cè)的多肽分子量大小為393kDa，PI=594。通過(guò)氨基酸

4、序列和結(jié)構(gòu)分析顯示EcGSla、EcGSlb和EcGSlc蛋白包都含了ATP結(jié)合區(qū)域，N糖基化序列，GSbetaGrasp功能區(qū)和GS催化功能區(qū)，這些功能區(qū)在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)EcGSla、EcGSlb和EcGSlc蛋白都為胞質(zhì)型蛋白。通過(guò)BLAST分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建可知EcGSla、EcGSlb和EcGSlc氨基酸序列與橡膠樹(shù)的相似性最高。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)清水、銨態(tài)氮及硝態(tài)氮三種不同培養(yǎng)條件下，水葫蘆根部和葉部

5、的EcGSla、EcGSlb和EcGSlc轉(zhuǎn)錄水平和GS活性進(jìn)行了分析。在根部，EcGSla和EcGSlc基因的轉(zhuǎn)錄主要受硝態(tài)氮影響；EcGSlb基因的轉(zhuǎn)錄受外界氮素形態(tài)影響不大；GS活性在氮脅迫和銨態(tài)氮處理初期受到了抑制，隨著處理時(shí)間GS活性的抑制解除，GS活性在硝態(tài)氮處理2h和6h時(shí)受到了明顯的抑制。在葉部，在清水，氯化銨，硝酸鉀處理下，EcGSla，EcGSlb和EcGSlc基因的轉(zhuǎn)錄都提高了，EcGSla基因的轉(zhuǎn)錄受氮脅迫的影響