16083.高產(chǎn)β胡蘿卜素大腸桿菌細胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

1、分類號：Q81密級：(秘密、機密、絕密)學校代碼：10057研究生學號：10809907高產(chǎn)p胡蘿卜素大腸桿菌細胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化ConstructionandOptimizationofEscherichiacoilCellFactoriesforI墨caroteneProduction工程領域名稱：輕工技術與工程研究方向：合成生物學指導教師姓名：郁彭教授張學禮研究員研究生姓名：趙婧申請學位類別：工程碩士論文提交日期：2013年3月論

2、文課題來源：中科院知識創(chuàng)新重要方向性項目學位授予單位：天津科技大學摘要B胡蘿卜素是類胡蘿b素家族中的典型代表，具有極強的淬滅單線態(tài)氧和清除自由基的能力，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域有廣闊的應用前景。大腸桿菌作為常用宿主菌具有遺傳背景清晰，容易培養(yǎng)、生物量大等優(yōu)勢，可用來生產(chǎn)B一胡蘿b素。本研究在大腸桿菌染色體上，引入外源B胡蘿卜素合成基因，使用不同強度的人工調(diào)控元件對大腸桿菌自身的MEP途徑、巾央代謝途徑進行優(yōu)化，并且加強了胡蘿b素合成基

3、因的表達強度，獲得了可以高產(chǎn)6胡蘿卜素的工程菌。首先，文中使用一步同源重組的方法對MEP途徑基因的表達進行修飾。使用6種強度差異很大的人工調(diào)控元件，對萜類合成途徑的8個基因進行調(diào)控，使p一胡蘿卜素產(chǎn)量提高了12～35倍。對于不同的基因，其最適的調(diào)控元件強度各不相同。研究發(fā)現(xiàn)用適當強度的調(diào)控元件對dxr、ispG和ispH基因進行調(diào)控后，也能提高6一胡蘿卜素的生產(chǎn)。為了克服質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，本文將來源于成團泛菌的B一胡蘿b素合成基因操縱子引

4、入火腸桿菌ATCC8739染色體中。根據(jù)MGl655的發(fā)酵結(jié)果，使用兩步同源重組的方法對MEP途徑的dxs、idi基因進行表達調(diào)控，使得D胡蘿b素的產(chǎn)量提高了35倍。在此基礎上對crt操縱子進行改造，使得產(chǎn)量再次提高了3，4倍。ATP和NADPH對于萜類物質(zhì)的合成是兩個重要的輔因子。為了提高ATP和NADPH供給，文中對ATP合成、磷酸戊糖途徑以及TCA循環(huán)三個中央代謝模塊進行改造。研究發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶基因(atp)的過表達，使得B胡

5、蘿b素產(chǎn)量提高了20％；磷酸戊糖途徑中轉(zhuǎn)醛酶基因(talB)過表達，可以使B胡蘿卜產(chǎn)量提高了17％；TCA循環(huán)中戧酮戊二酸脫氫酶基因(sucAB)的表達調(diào)控可以使B胡蘿b素產(chǎn)量提高了39％。TCA循環(huán)改造效果最好的原岡可能是提高TCA循環(huán)的代謝速率可以J司時提高ATP的合成速率和NADPH的生產(chǎn)速率。另外，本研究分別對TCA循環(huán)和磷酸戊糖途徑，TCA循環(huán)和ATP合成進行組合調(diào)控，發(fā)現(xiàn)前者對B胡蘿卜素的生產(chǎn)有協(xié)同的作用，后者沒有。最終得到