27034.深海沉積物微生物元基因組文庫(kù)來源的新的酯酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

1、中國(guó)科學(xué)院研究生院碩士學(xué)位論文指導(dǎo)教師塞室型硒究旦盟史國(guó)型堂醫(yī)邀生塑硒究壓申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別亟學(xué)科專業(yè)名稱運(yùn)佳堂論文提交日期星Q!Q：魚論文答辯日期窒Q!Q：魚培養(yǎng)單位史國(guó)科堂院邀生物巫窺壓學(xué)位授予單位生墾型堂院亞究生院答辯委員會(huì)主席生物，極大限制了人類對(duì)微生物遺傳資源的有效利用?，F(xiàn)代生物科技以及嚴(yán)峻的能源危機(jī)對(duì)新型工業(yè)用酶的需求日益旺盛，極大的促進(jìn)了新型開發(fā)環(huán)境遺傳資源技術(shù)手段的發(fā)展。而元基因組技術(shù)作為一種不依賴于培養(yǎng)的新理念和新方法，可以

2、克服上述瓶頸，使從探究環(huán)境中獲得大量未能培養(yǎng)的微生物成為現(xiàn)實(shí)。本研究的目的是從深海沉積物微生物元基因組文庫(kù)中克隆新的酯酶基因，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。本研究中，我們利用含有三丁酸甘油酯的酯酶選擇性篩選培養(yǎng)基，從深海沉積物微生物元基因組文庫(kù)中篩選得到酯酶陽|生Fosmid克隆。對(duì)篩選得到的fosmidFLIO進(jìn)行部分酶切構(gòu)建亞克隆文庫(kù)，篩選得到酯酶陽性亞克隆pFLSIO。PCR擊)。增目的片段后與pET28a連接構(gòu)建酯酶基因原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化

3、大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21。純化表達(dá)產(chǎn)物并對(duì)其進(jìn)行活性測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)研究。序列分析顯示該pFLSl0亞克隆質(zhì)粒含有一段924bp的ORE(OpenReadingFrame)，與一海洋元基因組文庫(kù)中篩選出的酯酶ADA70030序列一致性為7l％。該酶為一新的低溫酯酶，對(duì)C4底物(對(duì)硝基苯丁酸酯)水解能力最強(qiáng)。該酶最適作用溫度為20℃，最適作用pH為75，20℃時(shí)較為穩(wěn)定，pH8—10的范圍內(nèi)有良好的pH穩(wěn)定性，l、

4、M92對(duì)該酶具有一定的激活作用，Mn2等對(duì)其具有不同程度的抑制作用。應(yīng)用元基因組技術(shù)篩選到了新的酯酶基[]fls，O并進(jìn)行了克隆表達(dá)，該酶在低溫及堿性條件下較為穩(wěn)定且活力較高，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的應(yīng)用潛力。從環(huán)境中發(fā)掘重要的工業(yè)用酶用于工業(yè)應(yīng)用，有利于節(jié)約原材料、節(jié)省能源，對(duì)于促進(jìn)工業(yè)化發(fā)展和經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)具有重要意義，同時(shí)也為開發(fā)海洋微生物的其它重要功能基因提供有力借鑒，為尋求海洋微生物資源最大限度挖掘、可持續(xù)開發(fā)利用的科學(xué)途徑奠定理論