家蠶類胡蘿卜素加氧酶BmninaB基因的鑒定及功能研究.pdf

1、類胡蘿卜素加氧酶（Carotene Oxygenase）是一種氧化酶，能夠氧化裂解類胡蘿卜素產(chǎn)生維生素A(Vitamin A,VA)類物質(zhì)。在動(dòng)物體中，類胡蘿卜素的氧化裂解產(chǎn)物在視覺形成、細(xì)胞分化、免疫、基因表達(dá)調(diào)控、胚胎和生殖發(fā)育等過程中都有著十分重要的作用。在缺失該酶的果蠅(Drosophila melanogaster)視覺突變體ninaB中，維生素A和視網(wǎng)膜色素的含量比正常果蠅明顯減少，導(dǎo)致視覺喪失。而家蠶類胡蘿卜素加氧酶還未見

2、研究報(bào)道。本研究鑒定了家蠶類胡蘿卜素加氧酶基因（BmninaB），并通過RT-PCR、Real time PCR、Western blot及RNAi等技術(shù)對(duì)家蠶中該基因的表達(dá)模式及功能進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下：
　　1．家蠶BmninaB基因的克隆及鑒定
　　根據(jù)已報(bào)道的果蠅和大蠟螟（Galleria mellonella）ninaB同源基因的序列信息，在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中確定位于第12號(hào)染色體nscaf2825上的BGIB

3、MGA005193為其同源基因，但通過EST分析及克隆測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶基因組中起始位置注釋有誤，缺失了包括5’UTR在內(nèi)的兩個(gè)外顯子。最終確定家蠶BmninaB基因有兩種mRNA剪切型：其中第一種剪切型BmninaB-1由14個(gè)外顯子13個(gè)內(nèi)含子組成，全長mRNA為2153bp，其中編碼區(qū)1536bp，共編碼511個(gè)氨基酸；第二種剪切型BmninaB-2編碼區(qū)1422bp，缺失了496～606位共111個(gè)堿基，引起表達(dá)蛋白第3

4、4位氨基酸由T突變?yōu)镹，并缺失35到71位共37個(gè)氨基酸殘基。
　　2．家蠶BmninaB基因的時(shí)空表達(dá)模式檢測
　　根據(jù)家蠶BmninaB基因的全長序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR及Real time PCR檢測家蠶BmninaB基因在不同發(fā)育時(shí)期及五齡幼蟲各組織間的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶BmninaB基因在未受精和受精后1天的卵中有高量表達(dá)，隨后表達(dá)水平較低；在幼蟲期一直低水平表達(dá)；在蛹蛾期家蠶BmninaB基因的表達(dá)存在

5、雌雄差異，在雌性個(gè)體中的表達(dá)量顯著高于雄性。五齡3天不同組織的表達(dá)模式檢測結(jié)果顯示，家蠶BmninaB基因在頭和生殖腺高量表達(dá)，在其余檢測的8個(gè)組織中都只有少量表達(dá)。
　　3．家蠶BmninaB的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備
　　將家蠶BmninaB全長CDS連入pET-28a載體進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有少量蛋白以可溶形式存在，大部分以包涵體的形式存在。將純化的包涵體作為抗原免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體。末次免疫后抗血清

6、經(jīng)ELISA檢測效價(jià)超過1:12800，經(jīng)過Western blot檢測特異性較好。進(jìn)一步檢測各組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)該蛋白在頭、卵巢、神經(jīng)中表達(dá)量較高，在脂肪體和中腸中也有表達(dá)。
　　4．利用RNAi技術(shù)研究BmninaB基因的功能
　　體外轉(zhuǎn)錄合成用于干涉BmninaB基因的dsRNA，分別在上蔟后4天和6天注射雌蛹。在蛾期進(jìn)行解剖觀察和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，上蔟6天注射的三個(gè)梯度（80μg、150μg、220μg）中實(shí)驗(yàn)組同對(duì)