重金屬脅迫下甘蔗生理響應與金屬硫蛋白基因的功能鑒定.pdf

1、我國部分耕地受重金屬污染，利用重金屬超富集植物修復污染耕地具有經(jīng)濟和環(huán)境友好的特點。金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白，具有結合重金屬的能力，在調控重金屬積累與富集中起重要作用，因此，與植物耐受和富集鎘等重金屬的能力密切相關。根據(jù)前人研究，甘蔗具有耐受和富集銅、鎘等重金屬的能力，考慮到甘蔗還具有高生物量、可多年宿根等特點，因此，基于重金屬超富集植物的視角，研究重金屬脅迫下甘蔗的生理響應，克

2、隆甘蔗金屬硫蛋白家族基因并分析它們在重金屬應答中的功能，有助于深入研究MT家族基因的功能，并為評價甘蔗是否具有作為重金屬修復物種利用潛力奠定基礎，選題具有重要的現(xiàn)實意義和理論意義。本研究以甘蔗熱帶種Badila為材料，通過重金屬離子Cu2+、Zn2+或Cd2+脅迫下甘蔗表型、地上部和地下部富集重金屬離子的水平以及相關生理生化物質的測定，并進一步在克隆獲得4個分屬于不同亞家族成員的甘蔗金屬硫蛋白家族基因的基礎上，研究甘蔗MTs基因的響應特

3、點及其組織表達特性，初步探討了重金屬脅迫下的甘蔗生理響應以及甘蔗不同類型MTs基因在甘蔗應答重金屬脅迫中的功能。主要研究結果和結論如下：
　　1、甘蔗組培幼苗耐受與富集重金屬Cd、Zn或Cu的生理特性
　　甘蔗組培幼苗能夠耐受一定程度的重金屬Cd（100μM）、Zn（500μM）或Cu（100μM）的脅迫，并在處理期間無明顯的中毒癥狀。在脅迫初期（6 h），地上部丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量升高、過氧

4、化物酶(Peroxidase,POD)活性增加、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性和脯氨酸（Proline，PRO）含量下降，表明地上部氧化脅迫加劇；Cd2+和Cu2+脅迫后期（48 h），MDA含量下降、POD活性降低、CAT活性和PRO含量增加，推測甘蔗地上部組織抗氧化機制開始激活并逐漸適應脅迫環(huán)境。在高濃度重金屬Cd（250μM）、Zn（1,000μM）或Cu（250μM）的脅迫下，甘蔗Badila組培苗地上部和地下部能富

5、集到Cd2+、Zn2+、Cu2+的含量分別為7.83 mg/kg和223.33 mg/kg、228.63 mg/kg和1,165.67 mg/kg、16.02 mg/kg和404.70 mg/kg，并出現(xiàn)可逆的毒害癥狀。
　　2、甘蔗金屬硫蛋白家族基因的克隆與序列分析
　　采用同源克隆的方法，獲得了4個MTs基因。其中：
　　獲得1個1型MT基因，命名為ScMT1（GenBank登錄號：KJ504373），ScMT1的

6、cDNA序列結構如下：開放讀碼框長228 bp，編碼75個氨基酸，基因組序列含1個內含子（283 bp）、2個外顯子（52 bp和176 bp）。
　　獲得1個2型MT基因，命名為ScMT2-1-4（GenBank登錄號：KJ504375），ScMT2-1-4的cDNA序列結構如下：開放讀碼框長252 bp，編碼83個氨基酸，基因組序列含2個內含子（483 bp和853 bp）、3個外顯子（64 bp、87 bp和101 bp）。

7、
　　獲得1個3型MT基因，命名為ScMT3（GenBank登錄號：KJ504374），ScMT3的cDNA序列結構如下：開放讀碼框長198 bp，編碼65個氨基酸，基因組序列含1個內含子（259 bp）、2個外顯子（50 bp和148 bp）。
　　獲得1個1型MT基因的亞型，命名為ScMT6（GenBank登錄號：KJ504376），ScMT6的cDNA序列結構如下：開放讀碼框長243 bp，編碼80個氨基酸，基因組基因

8、含2個內含子（166 bp和114 bp）、3個外顯子（58 bp、84 bp和101 bp）。
　　生物信息學預測顯示，上述4個MTs基因所編碼的蛋白均屬于非分泌型酸性親水蛋白，分布在細胞質中的概率最高，主要功能是轉運和錨定作用，均無β螺旋結構，符合MT基因特點。
　　3、重金屬脅迫下甘蔗金屬硫蛋白基因的表達模式
　　利用實時熒光定量PCR技術，檢測了Cd（250μM）、Zn（1,000μM）、Cu（250μM）脅迫

9、0 h、6 h、24 h和48 h時間點的MT基因表達量。結果表明，從甘蔗中分離獲得的4個MTs基因對重金屬脅迫響應的模式存在差異。
　　甘蔗地上部和地下部中ScMT1基因的表達水平在Cd2+處理的前期和中期無明顯變化，但后期顯著上調表達，甘蔗地下部ScMT1對Cu2+脅迫的應答模式也是如此，ScMT1在甘蔗地上部受到Zn2+脅迫的誘導而呈總體顯著上調表達。上述說明ScMT1在甘蔗地下部響應Cd2+和Cu2+脅迫以及地上部響應Cd

10、2+脅迫中表現(xiàn)出正響應和一定的延遲效應，地上部全程正響應Zn2+脅迫并未出現(xiàn)延遲效應。
　　甘蔗地上部中ScMT2-1-4正響應重金屬脅迫，表達量顯著提高，說明了ScMT2-1-4主要在地上部發(fā)揮積極作用；在地下部中，ScMT2-1-4的響應呈變化態(tài)勢，Cd2+脅迫下呈下調表達，Zn2+脅迫下先上調后下調，Cu2+脅迫下呈初期和后期無顯著變化但中期大幅度上調表達，提示了ScMT2-1-4在甘蔗響應重金屬脅迫中起積極作用。
　

11、　Cd2+脅迫下，ScMT3在地上部上調表達不明顯，而地下部呈總體下調表達，提示了ScMT3甘蔗響應Cd2+脅迫過程中不起主要作用。在地上部中，ScMT3在Cu2+或Zn2+脅迫下呈持續(xù)顯著上調表達；地下部中ScMT3轉錄水平的顯著上調僅發(fā)生在處理前期，在處理中、后期則迅速下調且與對照無顯著差異；提示了ScMT3主要在甘蔗地上部響應Zn2+或Cu2+脅迫過程中起積極作用。
　　植物MTs亞家族的新成員ScMT6對重金屬脅迫的應答稍