鐵對Caco-2細(xì)胞及肉仔雞錳吸收的影響及其機(jī)制.pdf

1、本論文通過兩個試驗分別研究了鐵對Caco-2細(xì)胞及肉仔雞錳吸收的影響及其機(jī)制。
　　試驗一、研究了鐵處理對Caco-2細(xì)胞錳吸收的影響及其機(jī)制。本試驗包括2個小試驗。
　　試驗1、研究了不同接種密度對Caco-2細(xì)胞吸收模型分化及去極化評價指標(biāo)的影響，確定了細(xì)胞模型適用于吸收和轉(zhuǎn)運試驗的時間。將Caco-2細(xì)胞按高密度(1×105cells/cm2)、中密度(5×104cells/cm2)和低密度(3×104cells/cm

2、2)三個接種密度，分別接種于帶聚碳酸酯微孔濾膜插槽的Transwell6孔板上，培養(yǎng)29天，通過測定跨膜電阻值(TEER)、堿性磷酸酶活性(ALP)和酚紅透過率，評價細(xì)胞單層的完整性、極化和透過性。結(jié)果表明:高、中、低密度接種分別于第12、15和18天TEER值超過600Ω/cm2，第27、29和29天TEER值開始下降;高、中、低密度接種分別于第15、18和21天上、下側(cè)堿性磷酸酶活性的比值達(dá)到10倍以上，第29天開始降低;高、中、低

3、密度接種分別于第9、12和15天酚紅透過率小于0.5％。綜合上述三項指標(biāo)，高密度接種細(xì)胞在第15天、中密度接種細(xì)胞在第18天、低密度接種細(xì)胞在第21天開始，可以用于吸收和轉(zhuǎn)運試驗，27天以后細(xì)胞活力就開始下降，不適合做吸收和轉(zhuǎn)運細(xì)胞模型。
　　試驗2、研究了鐵處理對Caco-2細(xì)胞錳吸收的影響及其機(jī)制。采用單因子完全隨機(jī)試驗設(shè)計，共5個處理組，分別為正常含血清培養(yǎng)基、正常含血清培養(yǎng)基加鐵100μmol/L、正常含血清加鐵200μm

4、ol/L、無血清培養(yǎng)基添加鐵100μ mol/L和無血清培養(yǎng)基加鐵200μ mol/L，每個處理6個重復(fù)。分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第18～23天在培養(yǎng)基里以次氮基三乙酸絡(luò)合鐵的形式添加鐵，鐵處理120h結(jié)束后，在所有細(xì)胞培養(yǎng)液中以無機(jī)硫酸錳的形式添加800μ mol/L錳，37℃、50r/min水浴振蕩器上振蕩孵育120 min，收集細(xì)胞及上、下層培養(yǎng)液，測定其中鐵和錳含量;分別在鐵處理72和120h后收集細(xì)胞，測定二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT1

5、)、膜轉(zhuǎn)鐵蛋白1(FPN1)和十二指腸細(xì)胞色素還原酶b(Dcytb)mRNA及蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明:與不加鐵對照組相比，無血清培養(yǎng)基中添加鐵處理組細(xì)胞中鐵含量顯著高于對照組(P＜0.09)，有血清培養(yǎng)基中添加鐵處理組細(xì)胞中鐵含量無顯著提高(P＞0.31);無血清培養(yǎng)基中添加鐵處理組和有血清培養(yǎng)基中添加鐵200μmol/L處理組細(xì)胞對錳的攝取量(P＜0.03)和吸收量(P＜0.02)均顯著降低;鐵處理72h有血清培養(yǎng)基中添加鐵對DMT1

6、mRNA(P＞0.38)和FPN1(P＞0.43) mRNA無顯著影響，鐵處理120h有血清培養(yǎng)基中添加鐵200μmol/L和無血清培養(yǎng)基中添加鐵組DMT1(P＜0.01)和Dcytb mRNA(P＜0.05)水平均顯著降低，無血清培養(yǎng)基中添加鐵處理72和120h均顯著降低DMT1(P＜0.01)和FPN1(P＜0.05) mRNA水平，對Dcytb mRNA水平無顯著影響(P＞0.14);鐵處理72和120h對FPN1蛋白表達(dá)量均無顯

7、著影響(P＞0.89)，無血清培養(yǎng)基中添加鐵組DMT1蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.08)，有血清培養(yǎng)基中添加鐵組DMT1蛋白表達(dá)量無顯著變化(P＞0.44)。本研究結(jié)果提示，血清影響鐵處理細(xì)胞對錳的攝取和吸收以及細(xì)胞中DMT1、FPN1和Dcytb的表達(dá)，鐵處理細(xì)胞中DMT1和FPN1基因表達(dá)水平降低伴隨著攝取和吸收錳量的降低，表明鐵通過DMT1和FPN1調(diào)控細(xì)胞對錳的攝取和跨膜吸收。
　　試驗二、研究了鐵處理對肉仔雞錳吸收的影響

8、及其機(jī)制。采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計，共4個處理組，分別為不加鐵基礎(chǔ)飼糧組(0mg/kg)、以硫酸亞鐵(FeSO4.7H2O)形式添加100、250和500mg/kg組。將336只1日齡商品代羅斯308肉公雛，按體重隨機(jī)分為4個處理組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)14只雞，飼養(yǎng)至28日齡。分別在8、15、22和28日齡早晨空腹稱重、采血和屠宰取組織器官。28日齡對添加鐵水平為100和500mg/kg組雞進(jìn)行原位結(jié)扎十二指腸灌注8.74mmol/L

9、錳。結(jié)果表明，除添加鐵500mg/kg組1～14日齡日增重(P＜0.10)及1～7日齡采食量顯著(P＜0.03)顯著低于對照組外，飼糧鐵水平對其他各周生長性能指標(biāo)無顯著影響(P＞0.16);飼糧鐵水平對各周齡血漿總鐵結(jié)合力、血紅蛋白濃度及紅細(xì)胞壓積均無顯著影響(P＞0.16)，但顯著影響血漿鐵和血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(P＜0.09)，且各周齡血漿鐵和血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度均隨飼糧鐵水平增加而提高(P＜0.01);飼糧鐵水平除對第21和28日齡心

10、臟鐵含量無顯著影響(P＞0.23)外，顯著影響第7和14日齡心臟及各日齡肝臟、十二指腸、胰腺和骨灰鐵含量(P＜0.02)，且這些組織鐵含量均隨飼糧鐵水平增加而提高(P＜0.01);除各日齡肝臟和心臟錳含量無顯著變化外(P＞0.13)，各日齡十二指腸、胰腺和骨灰錳含量均隨飼糧鐵水平增加而降低(P＜0.01);飼糧添加鐵除降低第7日齡胰腺鋅含量外(P＜0.01)，對其他日齡胰腺和各日齡其他所測組織鋅含量、各日齡所測組織銅含量均無顯著影響(P

11、＞0.13);飼糧鐵水平顯著影響各日齡十二指腸粘膜DMT1和FPN1 mRNA水平(P＜0.10)，各日齡DMT1和FPN1 mRNA水平均隨飼糧鐵添加水平升高而降低(P＜0.10);飼喂添加鐵500 mg/kg飼糧組肉仔雞原位結(jié)扎十二指腸中錳的吸收率明顯低于飼喂添加鐵100 mg/kg飼糧組(P＜0.04)。本試驗結(jié)果提示，飼糧鐵通過調(diào)控十二指腸粘膜DMT1和FPN1的表達(dá)影響肉仔雞對錳的吸收。
　　綜上所述，體外細(xì)胞培養(yǎng)Cac