兩個玉米紋枯病病原誘導啟動子的克隆與功能鑒定.pdf

1、由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的玉米紋枯病是玉米生產上主要的真菌性病害之一，缺乏紋枯病主效抗病基因資源成為限制抗病品種培育和病害防治的主要因素之一。由于調控抗病相關基因的表達也可以提高植物抗病性，豐富的抗病相關基因資源有望成為抗病分子育種的策略之一。利用病原誘導啟動子驅動抗病相關基因的表達成為理想的手段，因而通過研究紋枯病病原誘導啟動子的功能，確定其誘導核心區(qū)段，可以為抗病基因工程提供在特異條件下表達

2、的載體平臺。此前實驗室已通過高通量測序技術分別對玉米紋枯病弱致病力菌株YWK-62和強致病力菌株YWK-196與玉米的互作在轉錄水平進行了研究，并獲得了一系列差異表達基因。本研究對其中兩個差異表達量較大的紋枯病誘導表達基因的啟動子PGRMZM2G127328和PGRMZM2G169240進行了研究，驗證相關啟動子的功能，并探討鑒定其響應玉米紋枯病菌誘導表達的順式作用元件。
　　本研究分別克隆了GRMZM2G127328和GRMZM

3、2G169240翻譯起始位點上游約2 Kb的DNA片段，并連接在GUS報告基因的上游以構建轉基因載體。通過農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化水稻品種中花11，分別獲得14株和10株轉基因株系。對陽性轉基因材料進行分析，發(fā)現(xiàn)PGRMZM2G127328和PGRMZM2G169240表現(xiàn)出豐富的組織表達模式并與玉米定量PCR檢測的結果相似。在接種紋枯病原YWK196后，兩個啟動子24 h內就能夠被高效誘導表達報告基因，從而驗證了相關啟動子受病原誘

4、導表達的能力。通過PLACE對兩個啟動子序列的分析發(fā)現(xiàn)，它們除了含有基本的調控元件外，都存在大量的特異性表達調控元件，如激發(fā)子響應元件等。對啟動子PGRMZM2G127328的系列截短及煙草瞬時表達接種實驗表明，-1416 bp至-1086 bp的缺失可以影響啟動子受病原菌的誘導表達，說明在這一區(qū)段內存在調控病原菌誘導表達的順式作用元件。對照PLACE的分析結果，該區(qū)段含有三個GT-1元件，而GT-1(GAAAAA)在水稻等作物中被驗證

5、是受病原菌和鹽脅迫誘導的作用元件。本實驗室同期李寧同學的研究也證明GT-1可以響應紋枯病菌YWK-196的誘導。將該區(qū)段內的GT-1進行缺失研究，其受紋枯病菌誘導的功能喪失，說明GT-1為啟動子PGRMZM2G127328的病原誘導核心元件。對啟動子PGRMZM2G169240系列截短研究表明，-1278 bp至-1183 bp的缺失能夠影響該啟動子受病原菌的誘導表達，說明在這一區(qū)段內存在正向調控病原菌誘導表達的元件。對該區(qū)段的PLAC

6、E分析表明，這一區(qū)域內未檢索到已知的病原誘導相關元件，說明在這一區(qū)域內可能存在新的病原調控調控元件。進一步將截短片段分段連接35 S mini的實驗表明，啟動子-1263bp至-1234bp這30bp的區(qū)域內存在一個受病原誘導的作用元件。綜上所述，本研究共驗證了兩個玉米紋枯病菌病原誘導啟動子的功能，確定了啟動子PGRMZM2G127328的病原誘導核心元件為GT-1，而啟動子PGRMZM2G169240中存在可以響應紋枯病菌誘導的新調控