紫薯甜菜堿醛脫氫酶基因BADH克隆及功能分析.pdf

1、甘薯營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界第七大糧食作物。如今甘薯在解決世界發(fā)展中國(guó)家的糧食安全問(wèn)題中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。紫色甘薯作為甘薯的一個(gè)新品種，不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，還富含花色素苷，除了顏色吸引消費(fèi)者外，更具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，但紫色甘薯較一般甘薯的薯塊要小，單位面積產(chǎn)量相對(duì)低一些，通過(guò)改良紫色甘薯品質(zhì)，提高紫色甘薯抗脅迫的能力，有助于提高紫色甘薯相對(duì)產(chǎn)量。在全球變暖的大背景下，土壤鹽漬化和極端溫度等環(huán)境條件已經(jīng)成為嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)和生態(tài)問(wèn)題。利用基因

2、工程手段遺傳改良作物耐受環(huán)境非生物脅迫的品質(zhì)，特別是耐鹽，耐旱和極端溫度的品質(zhì)是目前科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)和主要突破口。目前耐鹽脅迫主要從鹽離子區(qū)隔化，大量積累滲透調(diào)節(jié)小分子物質(zhì)和提高脅迫響應(yīng)基因表達(dá)幾方面來(lái)入手。在遺傳改良作物耐脅迫特性研究中，相溶性小分子物質(zhì)的作用越來(lái)越受到研究者的重視。這些小分子物質(zhì)作為一種滲透保護(hù)劑，在植物體內(nèi)能夠大量積累卻對(duì)植物基本無(wú)毒害，而且能夠從多方面保護(hù)植物，這使它們成為目前理想的遺傳改良靶點(diǎn)。甜菜堿類(lèi)小分子

3、物質(zhì)是典型的副作用小而耐鹽和低溫等多種非生物脅迫的一類(lèi)物質(zhì)，此類(lèi)物質(zhì)靶點(diǎn)單一，合成途徑的限速酶少，因此能節(jié)約成本和遺傳改良研究時(shí)間，相比改良其他代謝途徑的基因，可行性大大增加。甜菜堿醛脫氫酶作為甜菜堿這種滲透保護(hù)劑合成的關(guān)鍵催化酶曾被廣泛關(guān)注和研究，大量表達(dá)的甜菜堿醛脫氫酶基因在多數(shù)植物中能夠提高甘氨酸甜菜堿的積累量，使得經(jīng)過(guò)遺傳改造的植物能夠更好的適應(yīng)環(huán)境脅迫的壓力，在脅迫下的生長(zhǎng)狀況顯著優(yōu)于未經(jīng)改良的野生型植物。
　　本實(shí)驗(yàn)通

4、過(guò)對(duì)紫色甘薯甜菜堿醛脫氫酶的克隆和生物信息學(xué)分析，得到了一個(gè)CDS為1505bp的基因序列，共編碼505個(gè)氨基酸，保守結(jié)構(gòu)域具有典型的醛脫氫酶功能域和與輔酶NAD相結(jié)合的區(qū)域。通過(guò)序列多重比對(duì)分析和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)該基因與寧夏枸杞的同源性最高。通過(guò)構(gòu)建基于該基因的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)蛋白并進(jìn)行蛋白的純化和酶活測(cè)定，確定該蛋白在體外具有醛脫氫酶的催化功能。將該基因CDS序列與GFP綠色熒光蛋白載體連接共轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，通過(guò)激光共聚焦顯微

5、鏡觀察發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于葉綠體，與之前通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。而CMO基因（甘氨酸甜菜堿合成另一個(gè)關(guān)鍵酶）翻譯的蛋白位于葉綠體內(nèi)，這就使得調(diào)控IbBADH催化底物甜菜堿醛脫氫生成甜菜堿更為可行。最后通過(guò)對(duì)田間實(shí)生甘薯和水培甘薯生根幼苗的熒光定量分析進(jìn)一步說(shuō)明甜菜堿醛脫氫酶基因的表達(dá)與光合作用有著密切的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)甜菜堿醛脫氫酶功能的初步研究可以證明本實(shí)驗(yàn)所克隆的紫薯甜菜堿醛脫氫酶基因IbBADH是一個(gè)能夠催化甜菜