蛋雞子宮內(nèi)膜細胞鈣轉(zhuǎn)運及蛋殼鈣化早期鈣沉積機制的研究.pdf

1、目的：研究孕酮對蛋殼鈣化初期與鈣沉積相關(guān)的基質(zhì)蛋白和基因表達的影響，初步探討鈣化起始時的鈣沉積機制。
　　方法：本研究以產(chǎn)蛋高峰期蛋雞作為實驗動物，體外培養(yǎng)蛋雞子宮內(nèi)膜細胞，測定細胞生長曲線，檢測不同濃度的激素對細胞體外增殖和鈣離子濃度的影響，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)（RTQ-PCR）檢測不同處理組細胞中Cabp-d28k、Ca2+-ATPase、碳酸酐酶(CA)、TRPV6、骨橋蛋白(OPN)、卵鐵傳遞蛋白(Ovotrans

2、ferrin)、卵清蛋白(Ovalbumin)、Ovocleidin17和凝集素(Clusterin)等基因的表達量變化。在此基礎(chǔ)上對蛋雞進行孕酮和孕酮受體拮抗劑處理，蛋殼鈣化初期（排卵后4.5-5.5 h）采集子宮組織和蛋殼，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察蛋殼超微結(jié)構(gòu)變化，測定子宮中鈣離子濃度及相關(guān)基因表達量的變化規(guī)律，對基因的表達量變化與超微結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進行分析，并采用免疫組化和免疫印跡（Western-Blotting）分析Cabp

3、-d28k和Ovalbumin蛋白在子宮中的變化。
　　結(jié)果：本研究成功培養(yǎng)了蛋雞子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞，并測得兩種細胞的生長曲線；添加100 nM的孕酮能顯著（P<0.05）促進上皮細胞和基質(zhì)細胞的體外增殖；激素對體外培養(yǎng)的細胞中鈣離子濃度的影響不顯著（P>0.05），但雞體經(jīng)孕酮處理后子宮組織中的鈣離子含量顯著（P<0.05）下降。不同處理對子宮內(nèi)膜細胞和子宮組織中基因的表達量影響為：孕酮處理后Cabp-d28k、CA和O

4、PN mRNA在子宮中的表達量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）下降，OVA、Clu和OC17mRNA的表達量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）升高；孕酮受體拮抗劑處理后TRPV6 mRNA的表達量顯著（P<0.05）下降，OVA、OVO、Clu和OC17 mRNA的表達量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）升高。與對照組和拮抗劑處理相比，孕酮處理后蛋殼內(nèi)膜層和乳突層變厚，纖維直徑和結(jié)節(jié)直徑變大，乳突間隙和纖

5、維間隙變小，差異均達到顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）水平，且孕酮處理后Cabp-d28k、OVA、OVO以及OPN等基因的表達量變化與蛋殼超微結(jié)構(gòu)有相關(guān)性；免疫組化和Western Blotting分析結(jié)果表明，Cabp-d28k和Ovalbumin蛋白在不同處理組的子宮中均有表達，但Cabp-d28k蛋白在孕酮處理組中的表達量低于對照組和孕酮受體拮抗劑處理組，Ovalbumin蛋白則相反。
　　結(jié)論：蛋殼鈣化初期孕

6、酮顯著（P<0.05）抑制了Cabp-d28k和OPN在子宮中的表達，使蛋殼的乳突面積、乳突直徑和纖維間隙減??；孕酮顯著（P<0.05）促進了OVA和OVO的表達，使蛋殼的纖維徑和結(jié)節(jié)直徑增加；且使蛋殼內(nèi)膜層厚度和乳突層厚度增加。研究認為蛋殼鈣化初期孕酮可通過調(diào)控蛋雞子宮中與鈣化相關(guān)的基因和蛋白的表達，使蛋殼纖維內(nèi)膜層和乳突層結(jié)構(gòu)更致密，排列更有序，從而使增加蛋殼強度。本研究為蛋殼鈣化時鈣沉積的機制的進一步研究提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。