奶山羊乳腺上皮細(xì)胞及耳尖成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)人凝血因子Ⅸ基因的研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中，乳腺生物反應(yīng)器因其具有產(chǎn)量高、易收集、表達(dá)產(chǎn)物不進(jìn)入動(dòng)物體循環(huán)系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)，被用于制備蛋白的研究，部分乳腺生物反應(yīng)器已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)階段。如何進(jìn)一步提高乳腺生物反應(yīng)器的表達(dá)效率和表達(dá)產(chǎn)物活性成為了人們研究的重點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)選用具有新霉素抗性基因neorr表達(dá)框架的Plasmid GFP-PGK-Neor質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建了14kb的乳腺組織特異性表達(dá)人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)的同源打靶載體。通過PCR方法分別擴(kuò)

2、增奶山羊β-酪蛋白基因5'同源臂，人凝血因子Ⅸ基因，bGH PolyA序列，奶山羊β-酪蛋白基因3'及3'同源臂，并順序定向克隆于真核表達(dá)質(zhì)粒Plasmid GFP-PGK-Neor的多克隆位點(diǎn)。成功構(gòu)建以奶山羊β-酪蛋白基因上下游為同源臂，由奶山羊β-casein基因5'端上游序列調(diào)控hFⅨ基因轉(zhuǎn)錄，bGH polyA序列為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的組織特異性表達(dá)載體。經(jīng)限制性酶切片段分析及DNA序列測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，所構(gòu)建載體結(jié)構(gòu)正確。