一株雞傳染性貧血病毒強(qiáng)毒株的分離鑒定及其致病性和生物信息學(xué)分析.pdf

1、雞傳染性貧血?。–hicken infectious anemia,CIA）主要造成淋巴組織萎縮，雛雞再生障礙性貧血，骨髓脂肪化，皮膚和肌肉出血，導(dǎo)致免疫抑制，引起繼發(fā)感染或其它病原混合感染進(jìn)而造成巨大損失。在世界主要的養(yǎng)禽國(guó)，雞貧血病毒(Chicken anemiavirus,CAV)已經(jīng)普遍流行，其給養(yǎng)禽業(yè)帶來的損失日益嚴(yán)重，已經(jīng)逐漸成為一個(gè)全球性問題。該病毒還是禽弱毒疫苗中常見的外源病毒污染物之一，為此我們?nèi)斯つM了使用CAV低劑

2、量污染的弱毒疫苗對(duì)SPF雞的影響。有報(bào)道稱CAV主要對(duì)雛雞具有較強(qiáng)的致病性，對(duì)日齡較大的雞危害則不明顯，本研究從某表現(xiàn)明顯貧血癥狀的日齡較大雞群中分離鑒定到一株CAV野毒株，通過系統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了該毒株不同感染劑量和不同感染日齡的致病性，并對(duì)其基因組進(jìn)行了深入分析。
　　1、弱毒疫苗中CAV低劑量污染對(duì)SPF雞體重和疫苗免疫抗體的影響
　　為了觀察使用污染有低劑量CAV弱毒疫苗后對(duì)雞免疫和體重的影響，本試驗(yàn)通過人工模擬試驗(yàn)

3、觀察了CAV低劑量污染對(duì)SPF雞體重以及對(duì)NDV疫苗抗體產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示免疫接種污染10個(gè)EID50/羽和5個(gè)EID50/羽兩種劑量CAV的NDV疫苗后均造成了SPF雞體重顯著下降；并且NDV抗體水平與使用無污染疫苗組相比也顯著降低了。使用污染兩種劑量CAV的NDV疫苗后第2周開始均檢測(cè)到一定比例的CAV抗體陽性，而通過核酸檢測(cè)在使用污染疫苗后第1周就檢測(cè)到很高比例的CAV核酸陽性。研究結(jié)果不僅展示了弱毒疫苗中CAV污染對(duì)SPF雞生

4、產(chǎn)性能和免疫機(jī)能的影響，也提示我們?cè)谕ㄟ^SPF雞檢查法檢測(cè)外源病毒污染時(shí)增加對(duì)病毒核酸檢測(cè)有助于節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和提高檢出率。
　　2、CAV分離株對(duì)1日齡SPF雞的致病性
　　山東某種雞場(chǎng)部分2月齡雞生長(zhǎng)遲緩，隨后個(gè)體差異逐漸變大，其臨床表現(xiàn)為雞冠、肉垂蒼白。病理剖檢的主要特征是小腿骨骨髓呈粉紅色甚至淡黃色，胸腺萎縮。原始病料經(jīng)接種雞胚后，提取DNA經(jīng)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)為CAV陽性，證實(shí)成功分離到一株CAV野毒株，命名為CAV-SD

5、15株。將CAV-SD15株分別以150EID50,300EID50,700EID50,1500EID50四個(gè)劑量通過肌肉注射感染1日齡SPF雞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組研究其不同攻毒劑量下對(duì)1日齡SPF雞的致病性，每周對(duì)各組雞體重、血液指標(biāo)、抗體水平及病毒血癥檢測(cè)，同時(shí)記錄死亡率，第三周時(shí)全部剖殺檢測(cè)免疫器官指數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于空白對(duì)照組，不同劑量感染組均能夠引起顯著的生長(zhǎng)遲緩和免疫抑制（p＜0.05），感染組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)以

6、及NDV疫苗的抗體水平顯著降低（p＜0.05），但是150EID50和300EID50兩個(gè)攻毒劑量組之間部分結(jié)果差異不顯著。不同攻毒劑量下均能造成雞群一定的死亡率，1500EID50劑量攻毒組死亡率可達(dá)65％（7/20）。
　　3、CAV分離株對(duì)10周齡SPF雞的致病性
　　由于CAV一般只造成雛雞發(fā)病，但本毒株分離自2月齡發(fā)病雞，因此本研究針對(duì)10周齡的SPF雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，觀察該分離株對(duì)大日齡SPF雞的致病性。將CAV-

7、SD15株以1500EID50的劑量肌肉注射10只10周齡SPF雞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。五周內(nèi)每周對(duì)各組雞的體重、血液指標(biāo)、抗體水平及病毒血癥檢測(cè)，在15周時(shí)所有雞只剖檢同時(shí)測(cè)定免疫器官指數(shù)。結(jié)果顯示，盡管感染組沒有發(fā)現(xiàn)雞發(fā)病死亡，但相對(duì)于空白對(duì)照組，感染組表現(xiàn)出了顯著的生長(zhǎng)遲緩和免疫抑制（p＜0.05），免疫抑制的主要體現(xiàn)是感染組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著降低以及AIV-H9疫苗的抗體水平顯著降低（p＜0.05）。感染組表現(xiàn)出了明顯的貧

8、血癥狀，剖檢可見骨髓嚴(yán)重黃化，紅細(xì)胞數(shù)目最低僅為空白對(duì)照組的50%左右，這表明該分離毒株對(duì)大日齡SPF雞也有明顯的致病性。
　　4、CAV分離株全基因組分析
　　經(jīng)過擴(kuò)增測(cè)序得到CAV分離株的全基因組序列后，應(yīng)用MEGA、BioEdit等生物信息學(xué)軟件對(duì)CAV-SD15分離株的遺傳進(jìn)化關(guān)系以及編碼區(qū)氨基酸進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，SD15分離株與分離自臺(tái)灣的CAV18分離株同源性最高（98.9%），與分離自美國(guó)的NC001427株

9、同源性最低（93.9%）。遺傳進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)所比對(duì)的34個(gè)分離株主要分為兩個(gè)分支，SD15株在第二個(gè)分支上，并且與CAV18臺(tái)灣株分布于同一個(gè)小支上，顯示了較近的親緣關(guān)系；SD15株有16個(gè)氨基酸位點(diǎn)與其他參考毒株有較大差異，其中有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變是之前從未發(fā)現(xiàn)過的，分別為VP1蛋白210位的苯丙氨酸變異為絲氨酸，VP3蛋白25位的亮氨酸變?yōu)榻z氨酸。在VP3凋亡蛋白區(qū)域，SD15有兩個(gè)明顯的氨基酸突變且突變發(fā)生在弱凋亡誘導(dǎo)域內(nèi)部，我