大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、本論文克隆了大菱鲆mIgD基因cDNA全序列，序列特性分析顯示其含有免疫球蛋白家族所有的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析該基因在不同組織內(nèi)的差異表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鰻弧菌刺激后前腎中該基因的時(shí)空差異表達(dá)情況，推測(cè)魚(yú)類mIgD在免疫信號(hào)傳導(dǎo)及體液免疫防御中均可能起著重要作用。在序列分析的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行分段表達(dá)，構(gòu)建mIgD的δ區(qū)重組表達(dá)載體，并制備了其多克隆抗體。利用其與大菱鲆外周血白細(xì)胞間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示兩者發(fā)生了特異性

2、結(jié)合，說(shuō)明了外周血白細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在膜結(jié)合型mIgD。
　　本論文主要包括以下三部分：
　　1、大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆
　　設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的中間保守序列，通過(guò)RACE技術(shù)獲得mIgD cDNA序列，序列全長(zhǎng)3357bp，含一個(gè)2997bp的開(kāi)放閱讀框，編碼999個(gè)氨基酸，基因結(jié)構(gòu)為VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重鏈恒定區(qū)δ1~δ7氨基酸序列同源比對(duì)

3、結(jié)果顯示其與庸鰈（78％）、鱖魚(yú)（71%）、牙鲆（68%）具有較高的同源性，多序列比對(duì)結(jié)果顯示大菱鲆mIgD的每個(gè)δ恒定區(qū)內(nèi)均存在色氨酸與半胱氨酸保守位點(diǎn)。利用鄰位相連法構(gòu)建硬骨魚(yú)類免疫球蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示不同魚(yú)類IgD聚為一大支，大菱鲆mIgD與庸鰈及牙鲆聚為一支。
　　2、大菱鲆mIgD重鏈基因的表達(dá)分析
　　利用RT-PCR分析了大菱鲆mIgD重鏈基因的組織差異表達(dá)，結(jié)果顯示其在外周血白細(xì)胞、脾臟、前腎及中腎組織

4、中具有較高的表達(dá)。將大菱鲆腹腔注射福爾馬林滅活鰻弧菌后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了其前腎組織中mIgD重鏈基因應(yīng)答表達(dá)量，結(jié)果顯示mIgD重鏈基因在注射鰻弧菌后呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì)，在注射后8h時(shí)降至最低值，其相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的1/28左右，然后呈逐漸回復(fù)上調(diào)趨勢(shì)，在免疫后48h時(shí)免疫組mIgD相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異水平。
　　3、大菱鲆mIgDδ恒定區(qū)基因的重組表達(dá)及其多抗的制備
　　構(gòu)建了mIgDδ恒定區(qū)融合表達(dá)載體