早實枳FT類似基因的結構分析和功能驗證.pdf

1、柑橘在果樹生產中占有重要的地位，但其童期較長，達6-8年以上，嚴重阻礙了遺傳育種的進展，如何縮短童期受到越來越多的關注。1976年在湖北宜昌發(fā)現可以在2年內開花的枳的變異種—早實枳，并且它與普通枳一年一次開花不同，在一年內可多次成花，這為柑橘育種的研究提供了良好的材料。本實驗室在克隆早實枳成花關鍵基因FT時，得到2個不同的FTcDNA序列，命名為PtFT1和PtFT2，且又根據序列的差異人為設計了PtFT3及PtFT4。構建了4個PtF

2、T類似基因以及PtFTDNA全長序列在內的5個超表達載體，在模式植物煙草中異位表達，以分析早實枳中FT類似基因的功能及其與結構之間的關系。同時將PtFT1在柑橘中超量表達，觀察PtFT1超量表達對柑橘造成的影響和表型的變化，為進一步研究創(chuàng)造材料。主要結果如下:
　　 1.不同PtFT類似基因的結構分析，結果表明，PtFTDNA序列全長共包括4個外顯子和3個內含子，PtFT1為早實枳的成熟cDNA序列，有534bp，包括4個外顯子

3、;在PtFT1擴增的同時，還擴增到另一個序列PtFT2，相比PtFTDNA全長僅缺少了第一個內含子，而相比PtFT1則保留了另外2個內含子;PtFT2在翻譯時會在第二個內含子處提前終止，形成PtFT3，因此認為發(fā)揮基因功能的主要部位在前2個外顯子。但有文獻表明FT基因的第四個外顯子也有重要作用，因此將PtFT3之后的冗余序列單獨擴增，得到PtFT4。
　　 2.分別構建了35S::PtFTDNA、35S::PtFT1和35S::

4、PtFT4的超表達載體，分別轉化煙草，獲得了轉基因株系，并分別從DNA水平和轉錄水平進行了陽性檢測，均證明外源基因已經整合到煙草的基因組中。
　　 3.轉基因植株表型分析。對T2代的轉基因煙草開花時間及開花時葉片數統(tǒng)詩分析，發(fā)現35S::PtFTDNA，35S::PtFT1和35S::PtFT2樞對于野生型煙草均有早花效果，可提早開花90-100天，在植株為5cm、葉片4-5片時開始有花苞形成，而野生型植株花苞形成需要130天、

5、19片葉子。同時發(fā)現，上述轉基因植株生長過程中有明顯的分枝增多的現象。而35S::PtFT3和35S::PtFT4的轉基因煙草在開花時間及形態(tài)上都與野生型煙草一致，沒有特殊的表型。結果表明，PtFT基因的第一個內含子可能對基因的轉錄調控起一定作用，但不影響基因功能的發(fā)揮，但PtFT2中翻譯提前終止的序列以及冗余序列都失去了基因應有的功能，說明基因外顯子的完整性是保證基因功能發(fā)揮的前提。
　　 4.利用農桿菌介導的方法，通過抗生素

6、的篩選作用，獲得了普通枳35S::PtFT1轉基因植株，分別通過特異引物PCR陽性檢測和RT-PCR分析，證明該基因確實已經整合到普通枳的基因組中。但由于轉基因植株尚在生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)或剛移栽到田間不久，表型有待進一步觀察。
　　 5.優(yōu)化伏令夏橙遺傳轉化體系。為了遺傳轉化技術更好地在柑橘中利用，分析了不同種類激素在不同濃度下對伏令夏橙轉化體系的影響，結果證明適合伏令夏橙芽誘導的培養(yǎng)基為MT+1.0mg/L6-BA，根誘導的最適