人源福氏志賀菌對(duì)雞腸上皮細(xì)胞侵襲特性及其機(jī)制研究.pdf

1、眾多研究報(bào)道指出，志賀菌的宿主為人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。近些年，國(guó)內(nèi)外有志賀菌感染實(shí)驗(yàn)猴、家兔、犢牛和仔豬的臨床報(bào)道。許蘭菊、王川慶等于2004年首次報(bào)道了雞志賀菌病例，主要以雛雞膿血痢為特征。對(duì)中國(guó)部分地區(qū)有腹瀉病史的雞群進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，志賀菌抗體陽(yáng)性率達(dá)28.3％～33.7％，說(shuō)明雞志賀菌感染已成為中國(guó)雞群腹瀉疾病的重要病因之一。病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌在生物學(xué)及血清學(xué)特性等方面與人源志賀菌完全相同。從基因水平上看，雞源志賀

2、菌與人源志賀菌高度同源，可能起源于人源志賀菌，或是人源志賀菌新的亞種。在交互感染方面，以人源鮑氏志賀菌、人源福氏志賀菌進(jìn)行雛雞感染試驗(yàn)，組織免疫組化和電鏡結(jié)果檢測(cè)人源志賀菌能侵入雞腸道上皮細(xì)胞，證明人源志賀菌能感染雞，且人源福氏志賀菌致病性最強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著公共衛(wèi)生和人類(lèi)健康又面臨新的挑戰(zhàn)。
　　為研究人源志賀菌對(duì)雞致病性和相關(guān)侵襲特性提供體外模型，本研究建立了雞腸上皮原代細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。分別取不同日齡雞胚，采用0.1 g/L

3、Ⅰ型中性蛋白酶和300U/mLⅪ型膠原酶聯(lián)合分離純化雞腸上皮原代細(xì)胞，篩選雞腸上皮原代細(xì)胞最佳培養(yǎng)方法，并對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。然后采用0.125％胰酶和0.01％EDTA聯(lián)合消化進(jìn)行雞腸上皮原代細(xì)胞傳代。應(yīng)用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型膠原酶消化15日齡雞胚腸組織可獲得滿意的腸上皮細(xì)胞分離效果，細(xì)胞貼壁性良好。培養(yǎng)出圓形或多角形單層生長(zhǎng)呈“鋪路石樣”的細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞在12h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，24-48h明顯增殖，72h后細(xì)胞增殖速度減慢，生長(zhǎng)狀況不

4、良。經(jīng)透射電鏡觀察鑒定為腸上皮細(xì)胞。且傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好。制備的細(xì)胞可以連續(xù)傳代3代。建立雞腸上皮原代細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，可獲得純度較高的雞腸上皮原代細(xì)胞。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證人源志賀菌對(duì)雞的致病性并建立體外研究模型,采用Hela細(xì)胞慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)分離的人源福氏志賀菌ZD02株的侵襲毒力。然后采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色研究ZD02株對(duì)雞腸上皮細(xì)胞的侵襲力和相關(guān)侵襲特性。人源福氏志賀菌ZD02株能夠侵入Hela

5、細(xì)胞，慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染后30、60、90、120 min時(shí)ZD02株侵襲率分別為1.43％、2.43％、2.56％、2.62％，證明ZD02株具有侵襲毒力。ZD02株侵襲雞腸上皮原代細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，ZD02株能侵入雞腸上皮細(xì)胞，感染后1、2、3、4h時(shí)ZD02株侵襲率分別為1.7％、6.2％、8.0％、11.2％。雞腸上皮原代細(xì)胞經(jīng)EGTA處理后，ZD02株侵襲率顯著提高。結(jié)果證明人源福氏志賀菌ZD02株對(duì)雞

6、腸上皮細(xì)胞具有侵襲力，且從腸上皮細(xì)胞基底側(cè)部侵襲。本研究進(jìn)一步證明人源志賀菌對(duì)雞腸上皮細(xì)胞的侵襲力，具有人禽互傳的可能性，雞腸上皮原代細(xì)胞可作為研究志賀菌致病機(jī)理的體外模型。
　　為研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和骨架在人源福氏志賀菌侵襲雞腸上皮細(xì)胞中的作用。分別用酪氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白磷酸酶、蛋白激酶C、Ca2+通道等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑染料木黃酮、原釩酸鈉、星狀孢子素、硝苯地平和微絲蛋白聚合抑制劑細(xì)胞松弛素B處理雞腸上皮原代細(xì)胞后，采用細(xì)胞免

7、疫組織化學(xué)染色檢測(cè)人源福氏志賀菌ZD02株對(duì)雞腸上皮原代細(xì)胞侵襲率，用間接免疫熒光雙重標(biāo)記檢測(cè)ZD02株侵襲雞腸上皮原代細(xì)胞后F-肌動(dòng)蛋白分布的變化。染料木黃酮、硝苯地平和細(xì)胞松弛素B能顯著抑制人源福氏志賀菌ZD02株內(nèi)化，星狀孢子素和原釩酸鈉對(duì)ZD02株的內(nèi)化無(wú)影響，人源福氏志賀菌侵襲雞腸上皮原代細(xì)胞時(shí)F-肌動(dòng)蛋白發(fā)生聚集。人源福氏志賀菌ZD02株侵襲雞腸上皮原代細(xì)胞過(guò)程中需要酪氨酸蛋白激酶、Ca2+通道活化以及細(xì)胞微絲重排。