鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及耐藥性的初步研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌引起的主要侵害雛鴨、雛鵝等多種雛禽的一種接觸性、敗血性傳染病。發(fā)病鴨主要是依靠抗菌藥物進(jìn)行治療，但有報(bào)道常用的抗菌藥物對(duì)鴨疫里氏桿菌的敏感性逐漸下降，但對(duì)相關(guān)的耐藥機(jī)制仍缺乏較深入的研究，本論文以2010年江蘇某鴨場(chǎng)分離鑒定的鴨疫里氏桿菌為研究對(duì)象，探討了其對(duì)氯霉素類抗生素、氨基甙類抗生素和利福平的耐藥性及其耐藥機(jī)制。
　　本次試驗(yàn)首先從江蘇某發(fā)病鴨場(chǎng)共采集疑似樣品6份，對(duì)樣品進(jìn)行了鴨疫里氏桿菌的檢測(cè)

2、，試驗(yàn)從菌株形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性及16SrRNA檢測(cè)等方面對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定;然后采用微量稀釋法測(cè)定了15種抗菌藥物對(duì)鴨疫里氏桿菌臨床分離菌株的體外最小抑菌濃度(MIC);同時(shí)建立了PCR方法檢測(cè)分離菌株中介導(dǎo)利福平、氯霉素、氨基糖苷類抗生素耐藥的主要基因，對(duì)檢測(cè)到的氯霉素cat耐藥基因通過Southern雜交的方法進(jìn)行定位，并對(duì)利福平rpoB基因進(jìn)行突變位點(diǎn)的分析，對(duì)于檢測(cè)到的氨基糖苷類耐藥基因進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì);最后采用體外遞增

3、藥物濃度的方法誘導(dǎo)出氟苯尼考耐藥的里氏桿菌，并對(duì)人工誘導(dǎo)耐藥菌株的敏感性、生長(zhǎng)特性及耐藥機(jī)制進(jìn)行初步了研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:病鴨分離到的細(xì)菌經(jīng)形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)、生化特性測(cè)定及16SrRNA檢測(cè)，可鑒定為鴨疫里氏桿菌;本次鴨場(chǎng)分離的鴨疫里氏桿菌對(duì)氟苯尼考全部敏感，但對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、利福平、多黏菌素E、頭孢曲松鈉、四環(huán)素、氟喹諾酮類等藥物均表現(xiàn)出一定程度的耐藥;PCR檢測(cè)到的氯霉素耐藥基因主要為cat基因，應(yīng)用South

4、ern雜交方法檢測(cè)該基因主要定位于染色體基因組上。通過測(cè)序以及與Genbank中的基因?qū)Ρ?，發(fā)現(xiàn)對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的菌株主要檢測(cè)到的耐藥基因?yàn)閍ac和aadA。對(duì)利福平耐藥的菌株主要分析了其rpoB基因，通過測(cè)序和與敏感株序列及NCBI登陸的相關(guān)序列進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在4株利福平耐藥菌株中，均存在rpoB基因的突變，其中1株菌的rpoB在357、358位有堿基C和G的插入，360位有堿基A的插入，導(dǎo)致出現(xiàn)Glu-Asp和Asp-Hi

5、s氨基酸的突變;1株菌的rpoB在517位點(diǎn)發(fā)生堿基突變(T-C)，導(dǎo)致氨基酸Thr突變?yōu)镃ys;另外2株菌的383位堿基突變(G-A)，導(dǎo)致氨基酸由Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys。人工誘導(dǎo)的3株氟苯尼考耐藥的鴨疫里氏桿菌對(duì)氟苯尼考的MIC值均高于64mg·L-1，且發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)菌株對(duì)紅霉素的敏感性下降，部分菌株對(duì)紅霉素的MIC達(dá)到128mg·L-1;生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示:體外誘導(dǎo)的耐藥株生長(zhǎng)速度較親本株較慢，臨床分離親本菌株的23SrRNA及核糖體

6、蛋白L4及L22基因均未發(fā)生突變，而氟苯尼考誘導(dǎo)的3株菌中，未檢測(cè)到相關(guān)的氟苯尼考耐藥基因，但誘導(dǎo)耐藥株與親本株比較，均含有23SrRNA位點(diǎn)突變，其中1株耐藥菌的23SrRNA出現(xiàn)了A2078G，A2304T和G2083T突變;1株耐藥菌的23SrRNA出現(xiàn)了A2058T，A2126G和A2353T位點(diǎn)突變;1株耐藥菌的23SrRNA出現(xiàn)了A2045T，A2577G突變，在誘導(dǎo)菌中出現(xiàn)的A2126G和A2353T突變未見報(bào)道;檢測(cè)的3