PCR產(chǎn)物快速構(gòu)建重組桿狀病毒的方法及相關(guān)功能蛋白的研究.pdf

1、昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。對(duì)于BmNPV病毒載體系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的同源重組構(gòu)建重組病毒的方法存在重組效率低、技術(shù)復(fù)雜且耗時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題，即使通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組病毒也需要約2周左右的時(shí)間。本研究擬構(gòu)建一種快速構(gòu)建重組病毒的方法，無(wú)需多步克隆和篩選，操作簡(jiǎn)單方便、周期短。
　　本研究是在己構(gòu)建的復(fù)制缺陷型BmNPV穿梭載體RD-BmBacmid基礎(chǔ)上進(jìn)行研究的。首先，合成與RD-BmBac

2、mid有50bp同源的DNA片段:左重組臂RA-L、右重組臂RA-R，然后與目的基因通過(guò)重疊PCR得到含有50bp同源臂的PCR產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物與線性化的RD-BmBacmid共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞或家蠶幼蟲，一步產(chǎn)生重組病毒，無(wú)需篩選。
　　本研究中目的基因是AcGFP和DsRed兩種熒光蛋白報(bào)告基因。重疊PCR擴(kuò)增出含有50bp同源臂的PCR產(chǎn)物（AcGFP-DHA和DsRed-DHA），再與線性化的RD-BmBacmid共轉(zhuǎn)染B

3、mN細(xì)胞，可以觀察到細(xì)胞病變和熒光，表明重組病毒表達(dá)了相應(yīng)的目的蛋白。同時(shí)該方法也適用于家蠶幼蟲，可以觀察到轉(zhuǎn)染后的蠶體因表達(dá)相應(yīng)熒光蛋白而變綠或變紅。
　　在進(jìn)一步探究PCR產(chǎn)物快速構(gòu)建重組桿狀病毒機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)桿狀病毒LEF-3和AN分別是Red同源重組中的Beta和Exo蛋白的同源物，故克隆并表達(dá)純化LEF-3和AN蛋白以及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能。
　　本研究成功建立了一種快速構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，且能