黃檗組織培養(yǎng)及轉基因體系的建立.pdf

1、黃檗具有重要的經(jīng)濟和藥用價值，由于黃檗的育苗條件要求較高，技術難度大，移栽成活率低，生長緩慢，成材年限長，因此在引種栽培上尚未大面積推廣，野生資源缺乏，且目前存在自然更新困難、干形不通直、人工林種子敗育等問題。本研究針對黃檗現(xiàn)有問題，利用黃檗成熟合子胚建立了黃檗的快速高效的組培體系和轉基因體系，為黃檗優(yōu)良品種的開發(fā)奠定了基礎。 1．組織培養(yǎng)方面的研究表明：黃檗種子在6-BA和NAA作用下愈傷組織發(fā)生的最早，28℃條件下添加4.0

2、 mg/LTDZ和0.2 mg/LNAA的培養(yǎng)基中不定芽誘導率最高，為92.93％，平均誘導的不定芽個數(shù)最多，為25.03。最有利于黃檗不定芽生長的基本培養(yǎng)基配比為添加2％蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基。添加4.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基對不定芽的伸長生長最有效，兩周凈生長量達到3.75 cm。添加1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基中不定芽根的誘導率最高，達到85％。添加1.0 mg/L2,4-D或添加4.0 mg/

3、LTDZ和0.2 mg/LNAA的培養(yǎng)基中誘導出體細胞胚，誘導率分別為16.67％、1.22％和32.26％和2.02％。黃檗的胚乳在添加4.0 mg/LBA和0.2 mg/LNAA的培養(yǎng)基中誘導出一棵不定芽。 2．黃檗轉基因體系建立的研究表明：侵染時將種子縱切成兩半的方法既有利于農(nóng)桿菌的侵染，又能獲得較高的抗性芽誘導率?？剐匝空T導培養(yǎng)基中添加200 mg/L的頭孢霉素和10 mg/L的卡那霉素。最佳的共培養(yǎng)時間為28℃2d+4

4、℃2d，抗性芽誘導率達38.8％。共培養(yǎng)時期保留胚乳，共培養(yǎng)結束后清洗過程中剝離胚乳再轉入抗性芽篩選培養(yǎng)基能獲得更高效的抗性芽誘導率，并容易控制試驗材料外部菌類的生長?？剐匝吭谠鲋臣吧扉L生長過程中，芽基部愈傷組織塊切成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm左右為宜。試驗共獲得70個轉化子，進行DNA水平上的PCR，結果均為陽性。隨機挑選其中的5個黃檗轉基因植株進行PCR-southem檢測，RNA水平上的RT-PCR檢測，結果顯示外