鴨源新城疫病毒廣西強(qiáng)毒分離株遺傳進(jìn)化分析、檢測(cè)方法及DNA疫苗的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽類的一種高發(fā)病率和死亡率的烈性傳染病。目前我國(guó)山東、浙江和廣東等地相繼報(bào)道該疾病在鴨群中流行，已給養(yǎng)鴨業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本文對(duì)鴨源NDV廣西分離株GX19/2011進(jìn)行生物學(xué)特性的研究，結(jié)果表明:廣西分離株GX19/2011的ELD50為10-9.48/0.1 mL、MDT為51.4h、ICPI為

2、1.80、IVPI為2.82，推測(cè)該分離株GX19/2011為NDV強(qiáng)毒。用該毒株分別對(duì)35日齡和50日齡的鴨進(jìn)行人工感染，35日齡、50日齡的鴨的發(fā)病率都為100％，死亡率分別為100％，70％。對(duì)鴨源NDV廣西分離株GX19/2011的全基因進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行分析，該毒株全長(zhǎng)為15192bp，與F48E8，GD09-2，JS/1/02/Du，JS/1/97/Ch參考毒株的親緣關(guān)系較近，F(xiàn)基因核苷酸同源性為98.9％-99.1％，氨基酸的

3、同源性為99.6％-99.8％。但與Lasota的同源性相對(duì)較低，F(xiàn)基因核苷酸的為88.1％，氨基酸為91.9％。進(jìn)化樹分析表明，該分離株屬于基因Ⅸ。該分離株F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112R-R-Q-R-R-F117，符合強(qiáng)毒株的裂解位點(diǎn)的氨基酸組合。
　　 根據(jù)GenBank中鴨源NDV的F基因和鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)的V1/rep基因的保守序列各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并優(yōu)化擴(kuò)增條件，建立了同

4、時(shí)檢測(cè)鴨NDV和DuCV的二重PCR方法。該方法特異性好，對(duì)番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌等病原核酸無特異性擴(kuò)增。該方法的敏感性高，對(duì)鴨NDV的核酸最小檢測(cè)量為40fg,對(duì)DuCV的為20fg。根據(jù)GenBank公布的鴨源NDV、鴨瘟病毒(Duck Plague virus，DPV)和DuCV基因序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物并建立了鑒別診斷鴨源NDV、DP

5、V和DuCV的多重PCR檢測(cè)方法。該方法特異性好，對(duì)番鴨呼腸孤病毒、鴨源GPV、H5亞型流感、鴨源H9亞型流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、E.coli、禽多殺性巴氏桿菌等病原核酸無特異性擴(kuò)增;敏感性高，鴨源NDV、DPV和DuCV的核酸最低檢出限分別10pg、4pg、1.5 pg。對(duì)180份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果DuCV陽(yáng)性10份，陽(yáng)性率為5.6％;鴨源NDV陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率為0.56％。結(jié)果表明，建立的多重PCR方法可以應(yīng)用于鴨源NDV、DPV

6、和DuCV的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。根據(jù)鴨源NDV和DuCV保守基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)針對(duì)鴨源NDV和DuCV的特異性引物和2條不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針，建立了鴨源NDV和DuCV的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法特異性性好，對(duì)番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌等病原核酸無特異性擴(kuò)增;敏感性高，對(duì)鴨源NDV的最小檢測(cè)量是160拷貝，DuCV的為

7、140拷貝。應(yīng)用該方法對(duì)保存118份臨床病料核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出鴨副粘病毒和鴨圓環(huán)病毒陽(yáng)性感染率分別為0.85％和8.47％，無混合感染。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的三種方法都具有快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，適用于獸醫(yī)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
　　 根據(jù)鴨源NDV F基因和DuCV Cap基因開放閱讀框序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增出鴨源NDV的F基因和DuCV的Cap基因，并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1，成功構(gòu)建重組融合表達(dá)

8、質(zhì)粒 pcDNA3.1-F-Cap。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F-Cap轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，采用間接免疫熒光檢測(cè)到目的基因的體外表達(dá)。將pcDNA3.1-F-Cap作為DNA疫苗對(duì)2周齡的SPF雛鴨以胸部肌肉多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫，根據(jù)接種劑量的不同，分3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只，即接種劑量分別為100μg/只、200μg/只和300μg/只，同時(shí)設(shè)載體質(zhì)?？瞻捉M和滅活疫苗組，一免后兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。每次免疫前和

9、攻毒前各采一次血，ELASA檢測(cè)抗體水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示:各DNA疫苗免疫組的NDV抗體和DuCV抗體水平明顯高于載體空白對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05);二免后不同DNA劑量組間的抗體水平隨著免疫劑量的增大而增加，差異顯著(P＜0.05);二次免疫后，各疫苗試驗(yàn)組的抗體水平明顯高于一次免疫(P＜0.05)，說明加強(qiáng)免疫有利于抗體水平的提高。于第二次免疫后2周，使用分離株GX2011/19以滴鼻的方式每只SPR鴨接種0.5ml106.48