冷脅迫下茶樹(shù)蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)酮醇的研究.pdf

1、茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,溫度是影響茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。它不僅影響茶樹(shù)的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn),而且制約著茶樹(shù)的地理分布。茶樹(shù)喜溫怕寒,極端的低溫會(huì)導(dǎo)致茶樹(shù)不可逆的傷害甚至死亡。本文選取兩個(gè)茶樹(shù)品種“龍井43”和“皖茶91”,研究茶樹(shù)在冷脅迫條件下的生理生化響應(yīng),以及相關(guān)蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)變化。
　　(1)4℃、0℃處理龍井43和皖茶91新梢,檢測(cè)不同處理時(shí)間下茶樹(shù)葉片的細(xì)胞膜透性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、脯氨酸含量以及保

2、護(hù)酶類的活性,探討茶樹(shù)響應(yīng)冷脅迫的生理代謝反應(yīng)及代謝途徑。結(jié)果表明,隨著低溫處理時(shí)間的增長(zhǎng)和處理溫度的降低,茶樹(shù)葉片的細(xì)胞膜透性增強(qiáng);可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛含量升高;脯氨酸含量變化不明顯;保護(hù)酶類活性顯著增強(qiáng)。
　　(2)建立茶樹(shù)葉片雙向電泳技術(shù)平臺(tái)。4℃處理龍43茶苗,Tris-HCl/TCA法提取葉片蛋白,雙向電泳分離并分析差異表達(dá)的蛋白點(diǎn),獲得46個(gè)蛋白差異點(diǎn)。選取7個(gè)表達(dá)豐度較高且重復(fù)性好的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜MA

3、LDI-TOF-TOF-MS鑒定,其中5個(gè)是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶片段和其亞基,1個(gè)是該酶的活化酶,這些酶通過(guò)調(diào)控光合作用的卡爾文循環(huán)來(lái)抵御冷脅迫。1個(gè)是轉(zhuǎn)酮醇酶,該酶是戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵酶,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗氧化劑,協(xié)助清除生物體的活性氧。
　　(3)利用cDNA末端快速克隆技術(shù)獲取轉(zhuǎn)酮醇酶基因全長(zhǎng),共2572bp,其中開(kāi)放閱讀框2244bp,編碼747個(gè)氨基酸。通過(guò)序列分析和比對(duì),發(fā)現(xiàn)其具有硫胺素焦磷酸依賴酶超家族的保

4、守結(jié)合位點(diǎn)和C末端結(jié)構(gòu)域。
　　(4)在大腸桿菌中表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶基因的融合蛋白,利用兩種表達(dá)載體:pET32a(+)、pGEX-4t-2;兩種表達(dá)宿主菌:TransB(DE3)ChemicallyCompetentCell、Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell。融合蛋白在0.3mM誘導(dǎo)劑IPTG,16℃誘導(dǎo)16小時(shí)后成功表達(dá),基本為包涵體形式,質(zhì)譜鑒定后顯示匹配結(jié)果為轉(zhuǎn)酮醇酶。
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