羅非魚源無乳鏈球菌滅活疫苗的研制及其免疫效果的研究.pdf

1、近年來我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但羅非魚相關(guān)疾病的爆發(fā)頻繁發(fā)生，特別是鏈球菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究主要針對(duì)無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)對(duì)中國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的危害情況，以制備的無乳鏈球菌滅活疫苗為研究對(duì)象，主要進(jìn)行了無乳鏈球菌的分離鑒定及致病性分析、無乳鏈球菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化、無乳鏈球菌疫苗對(duì)吉富羅非魚的免疫保護(hù)試驗(yàn)。
　　試驗(yàn)從廣東、廣西、海南的羅非魚主養(yǎng)區(qū)發(fā)病的羅非魚體

2、內(nèi)分離出40株鏈球菌，通過傳統(tǒng)方法及16SrRNA分子生物學(xué)方法相結(jié)合的手段對(duì)分離的致病性菌株進(jìn)行鑒定，最終確定40株菌均為無乳鏈球菌，證明了無乳鏈球菌是華南地區(qū)羅非魚鏈球菌病的主要病原。實(shí)驗(yàn)還選取6株具有區(qū)域代表性的菌株對(duì)羅非魚進(jìn)行了致病性分析，以研究不同地區(qū)的菌株之間毒力的差異，篩選具有較好免疫原性的菌株作為制備疫苗的候選菌株。結(jié)果顯示，分離于廣東湛江的無乳鏈球菌顯示出較強(qiáng)的毒力，適合作為制備疫苗的候選菌株。
　　針對(duì)無乳鏈球

3、菌的培養(yǎng)與生長特性，本試驗(yàn)探討了腦心浸液(Brian HeartInfusion，BHI)培養(yǎng)基的營養(yǎng)因子、初始pH值、溶氧、溫度等因素對(duì)無乳鏈球菌生長的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)無乳鏈球菌培養(yǎng)基營養(yǎng)因子添加量進(jìn)行優(yōu)化，尋求無乳鏈球菌培養(yǎng)的最佳參數(shù)，以期為無乳鏈球菌疫苗的研制提供基礎(chǔ)資料。結(jié)果表明，無乳鏈球菌生長的最適初始pH為7～8，培養(yǎng)溫度為28～37℃，振蕩轉(zhuǎn)速為180～200rpm，在BHI培養(yǎng)基中添加2mg/mL的葡萄糖和20m

4、g/mL的酵母粉即可在對(duì)數(shù)期獲得最大細(xì)菌量。
　　本研究采用注射和浸泡2種免疫方法，對(duì)用無乳鏈球菌臨床分離株ZJ02福爾馬林滅活制備的疫苗進(jìn)行了免疫保護(hù)效果的研究。注射組以四個(gè)不同濃度的白油佐劑滅活疫苗免疫吉富羅非魚；浸泡組以相同濃度的滅活疫苗分別與消旋山莨菪堿、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化鈉三種不同佐劑免疫吉富羅非魚。在免疫后的不同時(shí)間里對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行尾靜脈采血，測定羅非魚血清中抗體效價(jià)水平、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活力、過氧化氫酶活

5、性和丙二醛含量。結(jié)果顯示，無乳鏈球菌疫苗對(duì)羅非魚具有較強(qiáng)的免疫原性，免疫組與對(duì)照組相比，血清中的抗體效價(jià)水平均顯著性提高，注射組和浸泡組的抗體效價(jià)最高分別達(dá)到1:256和1:128；注射組中不同濃度的疫苗免疫組獲得了較高的免疫保護(hù)率，高濃度組可達(dá)到95％；浸泡組中使用3種佐劑的免疫組免疫保護(hù)率分別為59％、64％、55％。免疫后羅非魚血清中的抗體效價(jià)水平、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活力、過氧化氫酶活性和丙二醛含量與對(duì)照組差異顯著(P<0