胸膜肺炎放線桿菌保守表面蛋白的鑒定與免疫原性研究.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)，是一種有莢膜的革蘭氏陰性球桿菌，它作為豬傳染性胸膜肺炎的病原體，引起全球養(yǎng)豬業(yè)的巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)莢膜多糖的不同，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種血清型的胸膜肺炎放線桿菌，它們在毒力和地緣分布上呈現(xiàn)多樣性。APP血清型的多樣性給它的預防和控制工作帶來了很大的困難。APP血清型的多樣性在致病與免疫機制的研究以及臨床和流行病學的應用方面都有很重要的意義。目前

2、，通常用來預防APP的疫苗為全細胞滅活苗或亞單位疫苗（如外毒素ApxⅠ，ApxⅡ或ApxⅢ，外膜蛋白）。但這些疫苗只能對同源或部分異源血清型的APP有較好的免疫保護作用。雖然減毒活疫苗也有效果，但由于安全問題，減毒苗尚未被批準用于豬場。因此，新型的能夠?qū)苟喾NAPP血清型的保護性抗原的鑒定及評估，是非常必要的。本研究通過對APP14個血清型標準菌株的比較基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析，結(jié)合生物信息學預測，鑒定出39個穩(wěn)定表達的保守的外膜蛋白和外

3、膜脂蛋白，并成功表達純化了其中12個蛋白。用動物實驗對其免疫原性進行了研究。
　　 1.胸膜肺炎放線桿菌的比較基因組雜交的研究分析
　　 根據(jù)三個完全測序APP菌株（血清3型JL03株，血清5型L20株和血清7型AP76株）的全基因組序列，用生物信息學方法預測了它們的保守表面蛋白。在APPJL03株的2097個ORFs中，有501個蛋白存在于細胞表面，375個蛋白有信號肽，其中有52個蛋白預測為外膜蛋白。經(jīng)過對APPL0

4、3株、L20株和AP76株的BLASTP分析，發(fā)現(xiàn)這三種血清型菌株之間有1851個同源基因，其中318個同源基因可能編碼表面抗原（271個膜蛋白和47個脂蛋白）。
　　 根據(jù)APPJL03全基因組序列設計連續(xù)的60nt的寡核苷酸探針，采用原位合成的方法制作高密度APP基因組芯片。提取14個血清型標準菌株（測試菌株）的基因組和JL03株（參考菌株）的基因組DNA，分別用Cy5和Cy3進行標記，分別與高密度APP基因組芯片進行雜交。

5、對芯片雜交數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)測試菌株與JL03株相比，差異基因的比例在2.9％-4.2％之間，并且有201個基因在至少一株測試菌株中缺失或顯著差異。一些已知的與血清型多樣性相關的基因位點（莢膜多糖合成基因簇、O-抗原合成基因簇、Apx毒素操縱子等）再次被確認，并發(fā)現(xiàn)了一些新的候選基因。在JL03株中發(fā)現(xiàn)了5個潛在的基因島(GI-1，-2，-3，4，-5)，它們可能與JL03株的血清型特異性相關。同時比較不同血清型的標準菌株和JL03株的

6、譜系關系，將這些菌株分成了4組，即1.1（血清型2，3，4，6），2.1(血清型5b和9)，2.2（血清型1，7，11，12），2.3（血清型5a，8，10，13）。該研究結(jié)果對進一步揭示APP的遺傳多樣性奠定了基礎。
　　 2.胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)錄譜的比較分析
　　 選取APP上的2866個非冗余的基因，設計寡核苷酸探針，采用原位合成的方法制作APP的表達譜芯片。分別提取14個血清型標準菌株的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成

7、cDNA，然后再合成cRNA，用Cy3進行標記，分別與APP的表達譜芯片進行雜交，根據(jù)雜交信號進行數(shù)據(jù)分析。轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，656個基因在所有菌株全基因組水平穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。結(jié)合比較基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，APP中三個占主要優(yōu)勢的基因座（莢膜多糖合成基因簇、O-抗原合成基因簇、Apx毒素操縱子）在不同的血清型之間有較大差異，這些基因的差異直接導致APP血清型的多樣性。此外，在14個APP血清型標準菌株中，有39個保守的表面蛋白基因均能穩(wěn)定

8、轉(zhuǎn)錄，可以作為潛在的疫苗候選靶標，對APP新型疫苗的開發(fā)具有重要指導意義。
　　 3.胸膜肺炎放線桿菌保守表面抗原的免疫原性研究
　　 根據(jù)比較基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析的結(jié)果，本研究從JL03株基因組中成功克隆了20個保守的表面蛋白基因到表達載體pET-28a中，并在大腸桿菌中成功表達了其中的12個，純化獲得12種重組蛋白。用小鼠模型比較研究了它們對同源血清型（血清3型JL03株）的免疫保護作用，然后，用其中3個免疫原性較