CodY轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對(duì)豬鏈球菌2型毒力的調(diào)控研究.pdf

1、豬鏈球菌2型是一種重要的人畜共患病原菌(Streptococcus suis serotype2，SS2)，其感染不僅嚴(yán)重危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，而且還危害威脅著人類的生命健康。近年來(lái)，關(guān)于豬鏈球菌2型致病性的研究越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的重視，目前除了一些經(jīng)典的毒力因子如莢膜多糖、溶血素和胞外釋放因子外，也有很多新型的毒力相關(guān)因子被證實(shí)，如雙組份調(diào)控系統(tǒng)SalK-SalR、CiaRH、孤兒調(diào)控因子CovR、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶SsPep等等。盡管很

2、多學(xué)者從不同的角度研究解釋豬鏈球菌2型的致病機(jī)理，但由于SS2致病是眾多毒力因子的協(xié)同作用，因此通過(guò)單個(gè)的毒力因子很難完全解釋其致病機(jī)理。實(shí)際上，對(duì)于病原菌來(lái)說(shuō)最有效率的方式就是于通過(guò)大量轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的相互作用，形成一個(gè)精細(xì)的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控整個(gè)細(xì)菌基因組的表達(dá)。
　　 目前對(duì)化膿鏈球菌的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)有了很深入的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)于SS2來(lái)說(shuō)這方面的研究還很有限。CodY是多種革蘭氏陽(yáng)性菌一種重要的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)控大量

3、毒力基因的表達(dá)，從而影響病原菌致病性。在化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等病原菌中均有codY究報(bào)道，但目前未見(jiàn)CodY在豬鏈球菌2型中毒力調(diào)控相關(guān)報(bào)道。本研究在SS2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33鑒定了一個(gè)CodY轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過(guò)構(gòu)建codY因突變株，研究突變株體外生物學(xué)特性，進(jìn)一步通過(guò)基因表達(dá)譜芯片篩選CodY可能調(diào)控的差異表達(dá)毒力相關(guān)基因，并利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，探討CodY對(duì)豬鏈球菌2型毒力調(diào)控機(jī)制，為深入闡明豬鏈球菌2

4、型的分子致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為豬鏈球菌新型疫苗和藥物靶標(biāo)的分子設(shè)計(jì)提供新的思路。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
　　 1.豬鏈球菌2型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CodY突變株△codY的構(gòu)建和鑒定
　　 參考豬鏈球菌2型05ZYH33全基因組序列，設(shè)計(jì)引物，以豬鏈球菌2型四川分離株(SC19)基因組DNA為模板，擴(kuò)增codY內(nèi)部一段基因codY’，這段基因不包括起始密碼和功能域(Helix-Turn-Helix domain，HTH)，利用

5、溫度敏感型型自殺性質(zhì)粒pSET4s，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSET4s-codY’。將重組質(zhì)粒pSET4s-codY’電轉(zhuǎn)化到野生菌株SC19感受態(tài)細(xì)胞中，利用壯觀霉素和溫度篩選獲得突變株。通過(guò)PCR、RT-PCR，測(cè)序和Western blot等證實(shí)codY突變株構(gòu)建成功，并將突變株命名為△codY。
　　 2.豬鏈球菌2型△codY的基本生物學(xué)特性研究
　　 對(duì)突變株△codY進(jìn)行基本生物學(xué)特性的研究，包括生長(zhǎng)速率的測(cè)定、形態(tài)

6、結(jié)構(gòu)觀察、溶血活性、細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)、小鼠半數(shù)致死量計(jì)算和組織載菌量的測(cè)定等。研究結(jié)果表明，△codY生長(zhǎng)速度顯著減緩；莢膜變薄且更疏松；細(xì)菌溶血能力減弱；對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附能力下降，對(duì)于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗殺傷能力減弱；小鼠半數(shù)致死量結(jié)果表明，突變株△codY比野生株毒力降低5.68倍；血液、肺臟、心臟和腦等組織器官中載菌量均低于野生株，且更易被清除。以上研究結(jié)果，突變株△codY毒力顯著低于野生菌株。
　　 3.豬鏈球菌

7、2型CodY調(diào)控機(jī)制及其致病機(jī)理的探討
　　 通過(guò)基因表達(dá)譜芯片，對(duì)突變株△codY-野生菌株SC19差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在整個(gè)基因組2178個(gè)基因中，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有164個(gè)，包括毒力相關(guān)基因、莢膜合成相關(guān)基因等；上調(diào)表達(dá)2倍以上的基因有214個(gè)，包括多種氨基酸合成相關(guān)基因、氮代謝相關(guān)基因等。選取部分毒力相關(guān)基因，進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。通過(guò)電泳遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoreti