植物耐鹽相關(guān)基因GarCIPK、SbHKT1的克隆與功能分析.pdf

1、植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常面臨鹽害、干旱、低溫等非生物脅迫，鹽漬作為自然界主要的非生物脅迫之一，是影響農(nóng)作物產(chǎn)量最為嚴(yán)重的因素之一。全世界鹽漬土面積約10億hm2，占世界陸地面積的10％，而且在進(jìn)一步擴(kuò)大。棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物，也是鹽堿地的先鋒作物，但土壤含鹽濃度超過(guò)0.3％，棉花的生長(zhǎng)發(fā)育便會(huì)受到嚴(yán)重的影響?，F(xiàn)有的棉花主栽培品種陸地棉耐鹽性總體水平不高，我國(guó)棉花的基礎(chǔ)種質(zhì)過(guò)于集中造成耐鹽品種遺傳基礎(chǔ)相當(dāng)狹窄，從而使得棉花

2、耐鹽品種的選育難以突破。因此，挖掘一些抗逆基因并進(jìn)行功能研究，具有重要的意義及應(yīng)用價(jià)值，可以為棉花的抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供潛在的有效候選基因。
　　 蛋白激酶、K+轉(zhuǎn)運(yùn)體HKT在植物的抗鹽等非生物脅迫途徑中起著非常重要的作用。本研究從棉屬野生種旱地棉（Gossypium aridum）中克隆了一個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)的蛋白激酶基因GarCIPK，并將此基因轉(zhuǎn)入煙草進(jìn)行初步的功能分析;將本實(shí)驗(yàn)室前期研究中克隆的海篷子K+轉(zhuǎn)運(yùn)體SbHKT蛋白基

3、因轉(zhuǎn)入煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證，并在棉花中進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究。
　　 1、GarCIPK基因的克隆與序列分析從本實(shí)驗(yàn)室旱地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選擇表達(dá)豐度高的一個(gè)蛋白磷酸激酶基因片段，利用電子克隆及RT-PCR方法獲得旱地棉的一個(gè)蛋白磷酸激酶基因（GarCIPK）。該基因的ORF全長(zhǎng)1350bp，編碼449個(gè)氨基酸，編碼蛋白大小為51.12 kD，理論等電點(diǎn)為8.13。與擬南芥和水稻中所有已知的CIPK進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，一致性分別在25.

4、11％-42.09％之間以及31.66％-73.95％之間。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明該基因在棉花幼苗期有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，葉片中該基因的相對(duì)表達(dá)量在鹽處理48h后最大，而在根中處理24h后表達(dá)量達(dá)最大。該基因組序列不合內(nèi)含子，啟動(dòng)子序列分析表明GarCIPK基因啟動(dòng)子區(qū)域包含脅迫應(yīng)答元件（ARE和LTR）、發(fā)育相關(guān)元件(CAT-box)及激素相關(guān)元件（GARE-motif）等調(diào)控結(jié)構(gòu)域。由以上結(jié)果推斷GarCIPK基因可能參與棉花幼苗期

5、對(duì)高鹽逆境脅迫的應(yīng)答，并可能在棉花耐鹽性機(jī)制中起著重要作用。
　　 2、GarCIPK基因的功能研究分別用CaMV35S啟動(dòng)子及逆境脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子RD29A與GarCIPK構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法將基因轉(zhuǎn)入煙草。轉(zhuǎn)基因煙草初步功能驗(yàn)證表明，在正常條件下的MS培養(yǎng)基上，過(guò)表達(dá)及逆境誘導(dǎo)表達(dá)GarCIPK的轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)與野生型對(duì)照的沒(méi)有顯著差異，而在150mM和200mMNaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系的根

6、長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于野生型對(duì)照;對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PEG干旱模擬試驗(yàn)，正常條件下的營(yíng)養(yǎng)液及添加10％PEG的營(yíng)養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)基因株系與野生型對(duì)照沒(méi)有差異，而在含20％PEG的營(yíng)養(yǎng)液中，野生型對(duì)照較轉(zhuǎn)基因株系萎焉嚴(yán)重。由此說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株具有較強(qiáng)的耐鹽和抗旱性。
　　 3、SbHKT1基因的功能分析及棉花轉(zhuǎn)化研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將海篷子的高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體SbHKT1基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得抗性再生植株，通過(guò)對(duì)T0代再生植株DNA水平PCR檢測(cè)