仔豬后腸中抗性淀粉降解的微生物機制.pdf

1、近年來，人們?nèi)找骊P(guān)注動物的腸道健康，因為腸道健康一定程度上決定了動物的健康。豬腸道特別是后腸中大量的微生物能夠發(fā)酵各種底物產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，其中丁酸對腸粘膜細胞正常生長和發(fā)育起重要作用，并且可以預防和治療后腸疾病。諸多研究表明，攝入抗性淀粉能夠促進后腸丁酸的產(chǎn)生。但由于抗性淀粉在產(chǎn)生丁酸的過程中，有大量腸道菌群參與，并且這一過程所經(jīng)歷的代謝途徑較多，同時還伴隨著時間和空間的復雜變化，因此，目前我們對抗性淀粉產(chǎn)生丁酸的過程尚不十分清楚。不

2、同種類淀粉在后腸發(fā)酵有何差異？腸道菌群的不同對于發(fā)酵抗性淀粉有何影響？在發(fā)酵過程中菌群變化是怎樣的？發(fā)酵過程中的中間產(chǎn)物對于促進丁酸產(chǎn)生有何影響？能夠降解抗性淀粉的菌都有哪些？為探究上述問題，本論文以仔豬為實驗動物，結(jié)合厭氧體外發(fā)酵技術(shù)，亨氏滾管厭氧分菌技術(shù)和16S rRNA基因分子生態(tài)技術(shù)，對抗性淀粉產(chǎn)丁酸過程的微生物機制進行了研究。
　　 本論文研究部分主要分為三章:
　　 一、體外發(fā)酵比較豬后腸微生物對支鏈淀粉和抗

3、性淀粉的降解
　　 為了比較豬后腸微生物對支鏈淀粉和抗性淀粉降解，本章以兩種抗性淀粉（RS2和RS4）以及易消化淀粉——支鏈淀粉為底物，利用斷奶仔豬結(jié)腸食糜為接種物進行體外發(fā)酵，研究了不同種淀粉之間發(fā)酵特性的差異。同時，還比較了結(jié)腸食糜和盲腸食糜對抗性淀粉RS2體外發(fā)酵的差異。結(jié)果表明，支鏈淀粉最易于被仔豬結(jié)腸微生物發(fā)酵，體外發(fā)酵累計產(chǎn)氣量、發(fā)酵液的揮發(fā)性脂肪酸濃度均顯著高于抗性淀粉組，發(fā)酵液pH值顯著低于抗性淀粉組。以支鏈淀粉

4、和抗性淀粉RS2為底物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸濃度變化相似，發(fā)酵6h內(nèi)濃度顯著升高，而后逐漸下降。結(jié)果還表明，抗性淀粉RS4不能被微生物降解。比較盲腸和結(jié)腸接種物發(fā)酵抗性淀粉RS2發(fā)現(xiàn)，盲腸接種物發(fā)酵產(chǎn)乳酸的速度較結(jié)腸接種物慢，而揮發(fā)性脂肪酸變化則沒有顯著差異。
　　 二、16S rRNA基因分子技術(shù)分析仔豬糞樣發(fā)酵抗性淀粉過程中菌群變化
　　 本章實驗分為兩部分內(nèi)容，第一部分:采用DGGE和Real-time PCR技術(shù)，對結(jié)腸糞

5、樣體外發(fā)酵支鏈淀粉和抗性淀粉，以及盲腸糞樣體外發(fā)酵抗性淀粉發(fā)酵過程不同時間點發(fā)酵液的菌群進行16S rRNA基因分子技術(shù)分析。結(jié)果表明，結(jié)腸糞樣發(fā)酵6h抗性淀粉組與支鏈淀粉組各時間點菌群相似性較高，達到80％以上，但發(fā)酵中后期相似性逐漸降低，到第24 h僅為70％。比較結(jié)腸和盲腸接種物發(fā)酵抗性淀粉發(fā)現(xiàn)，圖譜中大多數(shù)條帶為兩個腸段發(fā)酵樣品共有，其中最優(yōu)勢條帶A被鑒定為Subdoligranulum variablie(99％)，發(fā)酵12h

6、和24 h在兩組樣品中均出現(xiàn)新條帶B和C，它們均被鑒定為Blautia producta(99％)。Real-timePCR定量分析表明，結(jié)腸發(fā)酵支鏈淀粉與結(jié)腸發(fā)酵抗性淀粉總菌的數(shù)量在發(fā)酵中后期（12h和24 h）差異顯著（P＜0.05），擬桿菌數(shù)量在整個發(fā)酵過程中差異顯著(P＜0.05)，但梭菌Ⅳ群和雙歧桿菌并不顯著。結(jié)腸發(fā)酵抗性淀粉和盲腸發(fā)酵抗性淀粉組相比較，在發(fā)酵6h時總菌、擬桿菌、梭菌Ⅳ群均具有極顯著差異。各組發(fā)酵液中雙歧桿菌數(shù)

7、量在整個發(fā)酵過程中一直處于上升趨勢，但各組之間差異不顯著。第二部分:采用平板涂布和亨氏滾管方法對淀粉降解菌進行厭氧分離，并對所分離菌株進行16S rRNA基因序列測序，對其鑒定。實驗分離到30株淀粉降解菌，通過與基因庫數(shù)據(jù)進行比較，排除重復菌株，最終得到下列13株菌:菌株1，Clostridium perfringens;菌株2，Escherichia coli;菌株4，Streptococcussuis;菌株6，Anaerovibri

8、o lipolyticus;菌株8，Bacillus licheniformis;菌株10，Streptococcus caballi;菌株12，Streptococcus lutetiensis;菌株64，Clostridiumbutyricum;菌株65，Prevotella buccae;菌株70，Enterococcus canintestini;菌株74，Clostridium glycolicum;菌株75，Ruminoco

9、ccus gnavus和菌株33，Streptococcusbovis，根據(jù)菌落降解抗性淀粉產(chǎn)生的水解圈，判斷菌株1、4、12、65和33可能是通過釋放胞外酶的方式降解抗性淀粉;菌株2、8、64、70、74和75可能是通過緊密結(jié)合淀粉粒的方式降解淀粉;而菌株6和10僅在支鏈淀粉為唯一底物的培養(yǎng)基中出現(xiàn)，因此認為它們僅能夠降解支鏈淀粉。
　　 三、體外發(fā)酵比較仔豬糞樣微生物對L型乳酸和D型乳酸的利用特性
　　 本實驗首先測

10、定了長白妊娠母豬，長白仔豬和梅山仔豬結(jié)腸糞樣中L型和D型乳酸的含量。在此基礎(chǔ)上，以仔豬糞樣為接種物，以不同濃度（5和25 mmol/L濃度）L型乳酸、D型乳酸和L、D型混合乳酸為底物，研究仔豬糞樣微生物發(fā)酵L型乳酸和D型乳酸的特性。結(jié)果表明:結(jié)腸糞樣中乳酸含量個體差異較大（0.54±0.26 mg/g），品種和年齡對乳酸含量無顯著影響。體外發(fā)酵研究表明，仔豬糞樣微生物在5mmol/L濃度下對L型乳酸和D型乳酸利用速度無顯著差異，而在25

11、mmol/L濃度下，對L、D型混合乳酸利用速度最快，L型次之，D型最慢，發(fā)酵48h后，各型乳酸均被完全利用。仔豬糞樣菌群發(fā)酵L型和D型乳酸主要產(chǎn)生乙酸和丙酸，尤其在不同濃度組別比較情況下，丙酸的產(chǎn)生量和底物濃度具有相關(guān)性。在發(fā)酵過程中，L、D型混合乳酸產(chǎn)氣量較同濃度單一乳酸有較多的趨勢。
　　 本文的結(jié)果對了解抗性淀粉在單胃動物后腸中的降解規(guī)律提供了理論依據(jù):抗性淀粉能夠在后腸中被緩慢消化。在進一步的研究中，可以選擇淀粉抗性不同